張?jiān)佈菰?shī)詩(shī)，潘 鈺，馬春泉，于 冰，陳思學(xué)，李海英,*

(黑龍江大學(xué) a. 生命科學(xué)學(xué)院; b. 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱 150080)

鹽脅迫下甜菜M14品系BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH、BvM14-PsaD基因的表達(dá)分析

張?jiān)佈゛,b,c，戚詩(shī)詩(shī)a,b,c，潘 鈺a,b,c，馬春泉a,b,c，于 冰a,b,c，陳思學(xué)a,b,c，李海英a,b,c,*

(黑龍江大學(xué) a. 生命科學(xué)學(xué)院; b. 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱 150080)

甜菜M14品系是由栽培甜菜和野生白花甜菜雜交后獲得的帶有野生白花甜菜第9號(hào)染色體的單體附加系，具有抗逆、無(wú)融合等優(yōu)良特性。在前期工作中，對(duì)鹽脅迫下葉片膜蛋白進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，與未處理對(duì)照相比，200、400 mM鹽脅迫下共獲得50個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，選擇其中3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)為研究對(duì)象，與實(shí)驗(yàn)室前期相同鹽處理下獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，獲得基因cDNA全長(zhǎng)，將此3個(gè)基因命名為BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH和BvM14-PsaD；進(jìn)行在線功能預(yù)測(cè)；設(shè)計(jì)引物，對(duì)鹽脅迫(0、200、400 mM)處理下此3個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，了解在鹽脅迫下基因轉(zhuǎn)錄與蛋白水平上表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果表明，與未處理對(duì)照相比，200、400 mM鹽濃度處理下BvM14-ATPaseF基因分別上調(diào)3.70與4.47倍，BvM14-ATPaseH基因在鹽脅迫處理下分別上調(diào)0.85與1.36倍，而BvM14-PsaD基因隨著鹽濃度的增加卻下調(diào)0.97與2.54倍，表明在鹽脅迫下不同基因具有的功能不同，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的表達(dá)量并不完全相同。

甜菜M14品系；鹽脅迫；膜蛋白基因；熒光定量PCR

0 引 言

甜菜M14品系是郭德棟教授[1]利用栽培甜菜(B.vulgarisL.)與野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss.)進(jìn)行種間雜交及回交獲得的附加有野生白花甜菜第9號(hào)染色體的單體附加系。具有耐旱、耐鹽、耐寒和無(wú)融合生殖等優(yōu)良特性[2-3]，是挖掘甜菜優(yōu)質(zhì)基因和蛋白質(zhì)資源的優(yōu)質(zhì)材料。

實(shí)驗(yàn)室前期，楊樂(lè)[4]等對(duì)甜菜M14品系鹽脅迫下蛋白質(zhì)組進(jìn)行了深入研究。潘鈺[5]等利用iTRAQ技術(shù)對(duì)0、200、400 mM 鹽處理下甜菜M14品系葉片膜蛋白進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共得到50個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)與運(yùn)輸、光合作用、代謝、蛋白折疊和降解、蛋白合成、轉(zhuǎn)錄、脅迫和防御等相關(guān)。由于膜蛋白是生物膜的主要體現(xiàn)者，鹽脅迫下膜蛋白的損傷會(huì)引起植物一系列的生理變化[6-7]，進(jìn)行膜蛋白的研究是對(duì)前期蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步補(bǔ)充。

本研究選擇3個(gè)與膜蛋白功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析，并與實(shí)驗(yàn)室前期相同鹽處理下獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，獲得基因cDNA全長(zhǎng)；將3個(gè)基因分別命名為BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH和BvM14-PsaD；進(jìn)行在線功能預(yù)測(cè)；設(shè)計(jì)引物，對(duì)鹽脅迫(0、200、400 mM)處理下基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，探討3個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

甜菜M14品系(公開號(hào)：CN1263695A)，植物材料種植于黑龍江大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)田。

1.2 主要試劑

SYBR PremixEXTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒與RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0 試劑盒均購(gòu)自TAKARA公司； PCR檢測(cè)引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 基因功能預(yù)測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)與相同鹽處理下獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，獲得基因cDNA全長(zhǎng)，并利用NCBI與UniProt網(wǎng)站在線進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)。

1.4 基因設(shè)計(jì)引物

利用AlleleID 6.0軟件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期相同鹽處理下獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基因cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量特異引物(s：正向引物；as：反向引物)：

Ug16039s：5′-GAATCGTATCTGTGGCTA-CTG-3′

Ug16039as：5′-CGGACTTATTGCTATTG-ATGC-3′

Ug16567s：5′-GTGCTGGTGCTGCTTGTC-3′

Ug16567as：5′-GCTCCGTCTTCCCTCTCC-3′

Cl2797s：5′-AATATAAGAGCCTGACTGA-TTGTG-3′

Cl2797as：5′-CTGAAGCAAGAGCGGTTA-TTAC-3′

根據(jù)吳川等[8]設(shè)計(jì)甜菜M14品系18S rRNA管家基因熒光定量特異引物：

18S-s：5′-TGACGGAGAATTAGGGTTCG-3′

18S-as：5′-CCCCAATGGATCCTCGTTA-3′

1.5 鹽脅迫下甜菜M14品系葉片總RNA的提取與濃度、純度測(cè)定

采用TRIzol一步法分別提取0、200、400 mM 鹽處理下甜菜M14品系葉片總RNA[9]。利用DNA計(jì)算器測(cè)定RNA樣品在260 nm和280 nm下的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)28S、18S條帶的清晰度和相對(duì)含量，對(duì)總RNA的完整性進(jìn)行評(píng)估。

1.6 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù)TaKaRa公司RNA PCR Kit試劑盒，分別合成0、200、400 mM 鹽處理下甜菜M14品系葉片cDNA 產(chǎn)物。按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min；1 cycle。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

熒光定量PCR采用TaKaRa公司SYBR PremixEXTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，在Bio-Rad公司的MyiQTM2熒光定量PCR儀反應(yīng)，以甜菜M14品系的18S rRNA管家基因作為內(nèi)參，PCR反應(yīng)體系(35.0 μL)包括：SYBR PremixEXTaqTMII(2×)17.5 μL，cDNA模板3.5 μL，正向、反向引物各1.4 μL，ddH2O補(bǔ)至35.0 μL。反應(yīng)分為兩部分：第一部分?jǐn)U增反應(yīng)，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；59 ℃ 1 min；72 ℃ 30 s循環(huán)40次；第二部分建立溶解曲線，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將溫度升至95 ℃ 15 s；59 ℃ 1 min；再升至95 ℃反應(yīng)全部結(jié)束。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本研究采用比較Ct值法，即-ΔΔCT值法，對(duì)鹽脅迫下甜菜M14品系的3個(gè)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算公式為ΔΔCt=(Ct.差異基因-Ct.18s)Timex-(Ct.差異基因-Ct.18s)Time0。本研究中建立的反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)均設(shè)有3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜M14品系基因生物信息學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)室前期利用iTRAQ技術(shù)對(duì)0、200、400 mM 鹽處理下甜菜M14品系葉片膜蛋白進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的信息見(jiàn)表1。通過(guò)3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的Accession號(hào)與相同鹽處理下獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，結(jié)果見(jiàn)表2。查詢匹配獲得基因cDNA全長(zhǎng)，利用NCBI功能預(yù)測(cè)，將蛋白質(zhì)點(diǎn)ATP synthase CF1 alpha subunit命名為BvM14-ATPaseF(gi|126022791, Ug16039_R)基因，其完整的ORF為1 524 bp，共編碼507個(gè)氨基酸，利用UniProt網(wǎng)站預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白定位于葉綠體類囊體膜上，主要是一類CF1型ATP合成酶，是生物體中能量轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，主要參與氧化磷酸化和光合磷酸化過(guò)程，具有ATP合成或水解的活性[10-13]；同時(shí)，通過(guò)NCBI功能預(yù)測(cè)將蛋白質(zhì)點(diǎn)Chloroplastic photosystem I reaction center subunit II命名為BvM14-PsaD(gi|19855891, Ug16567_R)，其完整ORF為861 bp，編碼286個(gè)氨基酸，利用UniProt網(wǎng)站預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白也定位于葉綠體類囊體膜上，主要是一類膜外周蛋白，為PSI反應(yīng)中心亞基II類酶，其功能是在光合電子傳遞鏈中催化電子從質(zhì)體色素經(jīng)過(guò)一系列的電子傳遞到鐵硫蛋白的過(guò)程，并穩(wěn)固光系統(tǒng)I(PSI)光合膜上的色素蛋白復(fù)合物[14-15]。將蛋白質(zhì)點(diǎn)ATPase 11命名為BvM14-ATPaseH(gi|12230459, Cl2797)，基因完整ORF為2 259 bp，共編碼752個(gè)氨基酸，利用UniProt網(wǎng)站預(yù)測(cè)該蛋白定位細(xì)胞膜上，該酶是高度保守的多亞基內(nèi)膜質(zhì)子泵，以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力的形式推動(dòng)各種離子和小分子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[16]，由此產(chǎn)生細(xì)胞外部磷酸化和內(nèi)部的堿化來(lái)調(diào)節(jié)增長(zhǎng)反應(yīng)[17]，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 鹽脅迫下甜菜M14品系iTRAQ質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)序列信息

表2 鹽脅迫下甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因信息

圖1 BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD、BvM14-ATPaseH氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of amino acid conservative regions of three genes

2.2 甜菜M14品系葉片總RNA的提取鑒定

鹽處理(0、200、400 mM)下甜菜M14品系葉片總RNA濃度分別為1.055 μg/μL、2.421 μg/μL、1.516 μg/μL，A260/A280比值分別為1.896、1.904、1.890，結(jié)果表明提取的甜菜M14品系葉片總RNA純度較高。用1%瓊脂糖凝膠分離總RNA，結(jié)果見(jiàn)圖2，28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶的2倍，說(shuō)明所提取的總RNA完整性較好。

圖2 鹽脅迫下甜菜M14品系葉片總RNA檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Total RNA of leaves in M14 under salt stress

2.3 熒光定量PCR引物特異性檢測(cè)

熒光染料可以與所有的DNA雙鏈結(jié)合(包括引物二聚體)產(chǎn)生熒光，影響定量的準(zhǔn)確程度。由此，通過(guò)熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線分析，可以判斷引物是否具有特異性。內(nèi)參基因18S rRNA與BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD和BvM14-ATPaseH基因在甜菜M14品系不同濃度鹽脅迫下葉片實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線見(jiàn)圖3。

圖3 基因熒光定量PCR溶解曲線Fig.3 Real time fluorescent quantization PCR melting curve of genes

由圖3對(duì)內(nèi)參基因18S rRNA和甜菜M14品系BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD和BvM14-ATPaseH基因熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線可見(jiàn)，隨溫度升高，其熒光染料會(huì)與DNA雙鏈分離，未出現(xiàn)雜峰而且峰型單一，可表明試驗(yàn)中未有其它污染發(fā)生，無(wú)假陽(yáng)性存在，可用于差異基因的擴(kuò)增檢測(cè)。

2.4 基因的表達(dá)定量分析

對(duì)甜菜M14品系葉片BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD和BvM14-ATPaseH基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，該研究采用Ct值法，即-ΔΔCT值法，以未鹽脅迫處理的Ct值為對(duì)照計(jì)算得出數(shù)值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 甜菜M14品系中BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD、BvM14-ATPaseH基因的組織特異性表達(dá)Fig.4 Detection the expression level of BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD、BvM14-ATPaseH genes in M14 line

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與未處理對(duì)照組相比，200、400 mM鹽脅迫下BvM14-ATPaseF基因分別上調(diào)3.70與4.47倍，BvM14-ATPaseH基因分別上調(diào)0.85與1.36倍，BvM14-PsaD基因分別下調(diào)0.97與2.54倍。在400 mM鹽濃度處理下BvM14-ATPaseF蛋白上調(diào)0.54倍，BvM14-ATPaseH蛋白上調(diào)1.39倍，二者轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)含量相一致；在200 mM鹽脅迫處理下，BvM14-PsaD蛋白上調(diào)5.15倍，其轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)水平含量不同，表明在鹽脅迫下不同基因具有的功能不同，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的表達(dá)量并不完全相同。

3 結(jié) 論

數(shù)據(jù)顯示，在鹽處理下轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的表達(dá)含量并不完全一致，轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫下BvM14-PsaD基因下調(diào)表達(dá)，但在200 mM鹽脅迫下，該蛋白卻上調(diào)5.15倍，可能是因?yàn)辂}脅迫會(huì)導(dǎo)致植物氣孔不均勻的關(guān)閉，進(jìn)而可能影響色素與光的結(jié)合能力減弱，從而影響其PsaD蛋白參與光合作用[18]。BvM14-PsaD基因下調(diào)表達(dá)可能由于光合作用的降低導(dǎo)致含量降低。本研究中，鹽脅迫處理下BvM14-ATPaseF與BvM14-ATPaseH基因在甜菜M14品系葉片中顯著表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平含量一致。雖然目前關(guān)于植物在鹽脅迫對(duì)呼吸作用的影響報(bào)道并不一致，但在逆境條件下，植物可能需要提供額外的能量來(lái)維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育。鹽脅迫后，ATPase酶參與呼吸作用的加強(qiáng)用來(lái)滿足離子運(yùn)輸以及局部鹽分的變化[19-20]。由此可見(jiàn)ATP合成酶對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)滲透平衡有重要作用。

甜菜M14品系BvM14-ATPaseF、BvM14-PsaD和BvM14-ATPaseH基因與抵御鹽脅迫是否存在直接關(guān)系，還需要進(jìn)一步進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。這一結(jié)果也對(duì)探討甜菜M14品系與鹽脅迫的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Specific expression analysis of BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH and BvM14-PsaD under salt stress of sugar beet M14 lines

ZHANG Yong-Xuea,b,c，QI Shi-Shia,b,c，PAN Yua,b,c，MA Chun-Quana,b,c，YU Binga,b,c,CHEN Si-Xuea,b,c，LI Hai-Yinga,b,c,*

(Heilongjiang University a. College of Life Sciences; b.Key Laboratory of Molecular Biology, College of Heilongjiang Province; c. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education, Harbin 150500, China)

Sugar beet M14 line is a unique germplasm that contains genetic materials from Beta vulgaris L and Beta corolliflora Zoss and exhibits tolerance to salt stress. In previous work, it was focusing on analyzing proteomic protein quantitative of the leaf membrane. Under salt stress, 50 proteins exhibited differential protein level changes. We regard 3 of 50 as research object to get full length of genes with prediction function online, and design primers by using the transcriptome data. Using Real-time PCR to analysis the expression of the genes which under the treatment of salt stress (0, 200, 400 mM). The result shows that， theBvM14-ATPaseFgene is up-regulated 3.7 and 4.47 respectively compared with control. And the expression ofBvM14-ATPaseHgene is also up-regulated 0.85 and 1.36. However, different results appear inBvM14-PsaDgene, 0.97 down-regulations in 200 mM and 2.54 in 400 mM salt stress processing. The function of gene is not consistent so that the level of transcription is not entirely consistent with the protein level. Therefore, M14 has been used as an abundant genetic resource for isolating valuable genes in wild species.

sugar beet M14; salt stress; membrane genes; real-time PCR

10.13524/j.2095-008x.2015.04.064

2015-07-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471552、31401441)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C201202)；黑龍江省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2014TD004)；黑龍江大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(hdtd2010-05)；黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX2015-030HLJU)

張?jiān)佈?1990-)，女，黑龍江雙鴨山人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail:xuezylemon@foxmail.com；*通訊作者：李海英(1968-)，女，黑龍江肇東人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：lvzh3000@sina.com。

O436

A

2095-008X(2015)04-0049-06