牛志立 綜述，張平安 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 430060)

?

·綜 述·

棒狀和環(huán)狀蛋白在丙型肝炎病毒感染治療中的研究進(jìn)展

牛志立 綜述，張平安 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 430060)

丙型肝炎病毒；聚乙二醇干擾素-α；利巴韋林；RR抗體

丙型肝炎病毒(HCV)是單股正鏈RNA病毒，全球超過(guò)1.7億感染者，僅15%的感染者能自行清除HCV，大部分發(fā)展為慢性持續(xù)性感染，部分患者可發(fā)展成為肝硬化和肝癌。臨床治療發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)化聚乙二醇干擾素(Peg-IFN-α)和利巴韋林聯(lián)合用藥，慢性丙型肝炎(簡(jiǎn)稱丙肝)總體有效率不佳并且藥物不良反應(yīng)多。最近研究表明，HCV感染者經(jīng)Peg-IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療后，體內(nèi)可出現(xiàn)棒和環(huán)狀(RR)自身抗體，尤其在無(wú)應(yīng)答和復(fù)發(fā)的患者中比率較高。本文將從HCV、RR結(jié)構(gòu)，以及HCV治療和RR抗體之間的關(guān)系進(jìn)行分析，綜述如下。

1 HCV

HCV屬于黃病毒科，是單股正鏈RNA病毒，其宿主限于人類和黑猩猩，可引起人類丙型病毒性肝炎[1]。HCV基因全長(zhǎng)約9 600 kb，編碼3 014個(gè)氨基酸多聚蛋白前體，經(jīng)宿主細(xì)胞和病毒自身蛋白酶裂解成3種結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白、E1和E2)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[2]。HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞主要通過(guò)病毒蛋白和細(xì)胞表面分子CD1、LDL受體、清道夫受體B1、緊密連接蛋白-1和緊密連接蛋白Occludin相互作用，并借助細(xì)胞內(nèi)機(jī)制完成自我復(fù)制[3]。由于其RNA依賴性RNA聚合酶缺乏3′-5′外切酶活性，從而導(dǎo)致HCV-RNA的高突變率[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，HCV基因型有6型，其中基因型1、2、4、5普遍存在于非洲，而基因型3和6在亞洲較為常見(jiàn)[5]。

HCV持續(xù)感染可能與病毒通過(guò)破壞宿主防御功能有關(guān)[6]。從1990～2005年，全球血清HCV抗體陽(yáng)性率從2.3%上升至2.8%。其中中亞和東亞，北非和中東患病率最高(>3.5%)，東歐和西歐次之(1.5%～3.5%)。目前慢性丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方法是Peg-IFN-α和利巴韋林聯(lián)合用藥，但是總體有效率不佳，其中HCV 1b型慢性丙肝者僅為50%[7]。同時(shí)，Peg-IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療的不良反應(yīng)和患者的耐受性差，以及治療晚期患者的有效率較低的情況也不容忽視。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RR自身抗體與Peg-IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療HCV感染具有一定的關(guān)系。

2 RR結(jié)構(gòu)

1987年首次提出RR并命名為Nematin，后被證實(shí)為棒狀抗原。RR是一種新型的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，既不富含波形蛋白、微管蛋白或肌動(dòng)蛋白，也沒(méi)有與任何已知細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)，并且不具有脂質(zhì)雙層膜的58×103大小的蛋白質(zhì)[8]。RR形狀主要包括棒狀和環(huán)狀。棒狀蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的位置主要有兩種，一種是沿著細(xì)胞核膜分布，另一種是散在分布在胞漿中，見(jiàn)圖1。RR在大鼠(NRK)、大鼠(PTK2)和小鼠(3T3，RAW264.7)細(xì)胞系中較為常見(jiàn)，在人細(xì)胞株內(nèi)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。到目前為止，RR的組成部分主要包含67×103的胞苷三磷酸合成酶(CTPS)和55×103的肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)，有無(wú)其他成分尚有爭(zhēng)議[8]。

注：紅色箭頭指環(huán)狀蛋白，白色箭頭指棒狀蛋白緊貼細(xì)胞核膜，黃色箭頭指棒狀蛋白位于胞漿。

圖1 RR在細(xì)胞中的免疫熒光模型

2.1 CTPS和IMPDH 人CTPS有2個(gè)亞型，即CTPS1和CTPS2，具有74%相同的氨基酸[9]。CTPS能夠催化尿苷三磷酸生成胞苷三磷酸及核酸和磷脂的生物合成。目前，CTPS主要作為抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲(chóng)治療的靶向分子。IMPDH有2個(gè)亞型，即IMPDH1和IMPDH2，具有84%相同的氨基酸序列[9]。IMPDH能夠催化肌苷單磷酸(IMP)轉(zhuǎn)化為黃苷-5′-單磷酸，是啟動(dòng)合成鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的限速步驟。IMPDH是細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)器，是腫瘤和病毒性疾病治療的靶向分子。

2.2 RR的其他成分 Stinton等[10]利用RR陽(yáng)性的血清和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)RR的其他靶抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種蛋白陽(yáng)性，包括Myc基因相關(guān)的鋅指蛋白、電壓依賴性陰離子通道1、錨蛋白重復(fù)及SAM結(jié)構(gòu)域蛋白6、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1及3個(gè)未知功能的蛋白質(zhì)。這7種蛋白在功能上具有相似性，均參與嘌呤代謝、蛋白質(zhì)折疊和聚合。雖然蛋白芯片能檢測(cè)RR相關(guān)蛋白，但是無(wú)法闡明這些蛋白質(zhì)在RR結(jié)構(gòu)中的定位，而且蛋白中表位互補(bǔ)的干擾不利于免疫熒光定位研究RR的立體結(jié)構(gòu)，這需要結(jié)合其他技術(shù)對(duì)RR進(jìn)一步研究，如采用質(zhì)譜儀對(duì)RR結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。

3 RR生物學(xué)功能

RR結(jié)構(gòu)在人細(xì)胞培養(yǎng)中很難找到，只有在IMPDH和CTPS抑制劑或營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下才會(huì)形成RR，但是在非人細(xì)胞系，如大鼠NRK細(xì)胞和小鼠細(xì)胞系3T3等，即使不經(jīng)過(guò)任何處理也會(huì)有RR結(jié)構(gòu)。

3.1 棒與環(huán)的關(guān)系 通過(guò)記錄活細(xì)胞免疫熒光時(shí)間點(diǎn)圖像表明，RR結(jié)構(gòu)開(kāi)始很小，隨后逐漸增大至5～10 m形成成熟尺寸[11-12]。目前尚不清楚，棒和環(huán)是否具有相同的功能，以及兩種結(jié)構(gòu)間是否相互轉(zhuǎn)換，見(jiàn)圖2。

圖2 棒狀和環(huán)狀蛋白結(jié)構(gòu)

3.2 RR結(jié)構(gòu)的形成 癌細(xì)胞和原代細(xì)胞使用IMPDH抑制劑如利巴韋林和霉酚酸(MPA)，MPA 15～30 min，或CTPS抑制劑，如重氮氧代正亮氨酸和阿西維辛2～3 h均可誘導(dǎo)RR形成[8]。甚至上述細(xì)胞株在無(wú)谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h也可以獲得RR[11]。經(jīng)過(guò)無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)的小鼠未分化胚胎干細(xì)胞幾乎可以100%觀察到RR結(jié)構(gòu)，這與小鼠胚胎干細(xì)胞具有高度增殖性有關(guān)。由于快速增殖的細(xì)胞會(huì)消耗GTP/CTP，導(dǎo)致GTP/CTP數(shù)量減少而引起RR形成[8]。然而，NRK和RAW264.7細(xì)胞株較3T3、PTK2和CHO細(xì)胞株細(xì)胞增殖快，但是NRK、PTK2、3T3、CHO和RAW264.7細(xì)胞株不經(jīng)過(guò)任何處理均可表現(xiàn)出RR[10]。這說(shuō)明RR的形成可能并不只與細(xì)胞增殖速率和GTP/CTP消耗相關(guān)，還可能與宿主核苷酸代謝率和對(duì)GTP/CTP水平變化的敏感性有關(guān)。

用CTPS 和IMPDH抑制劑或無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)的mESCs和NRK、PTK2、3T3和RAW264.7細(xì)胞株形成的RR可被抗RR血清、抗IMPDH2抗體或抗CTPS1抗體檢測(cè)，這表明誘導(dǎo)的RR和天然RR在結(jié)構(gòu)上是相似的。然而，目前還不清楚它們是否具有相同的分子組成。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)生成的RR與天然形成的RR存在棒和環(huán)的比率差異，天然RR在胚胎干細(xì)胞中90%是環(huán)，而被CTPS或IMPDH抑制劑或無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)的細(xì)胞中90%是棒。同時(shí)CTPS或IMPDH抑制劑誘導(dǎo)形成RR后，可導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞的增殖數(shù)量下降。

3.3 棒在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的差異 CTPS或IMPDH抑制劑或無(wú)谷氨酰胺處理的細(xì)胞同樣可以在細(xì)胞核中檢測(cè)到RR結(jié)構(gòu)，但是與細(xì)胞質(zhì)中的RR結(jié)構(gòu)具有一定差異。細(xì)胞核內(nèi)的棒狀結(jié)構(gòu)比細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)小，見(jiàn)圖3。核棒長(zhǎng)度1.6～4.5 m，而同一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中棒長(zhǎng)度2.5～16.8 m[9]。這表明核棒比細(xì)胞質(zhì)棒短得多。雖然核棒和細(xì)胞質(zhì)棒具有高度的相似結(jié)構(gòu)，但是由于其亞細(xì)胞定位差異，目前尚不清楚它們是否具有相同的功能。

注：紅色箭頭指細(xì)胞核內(nèi)的棒狀蛋白，白色箭頭指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棒狀蛋白。

圖3 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棒狀蛋白

3.4 RR結(jié)構(gòu)的檢測(cè) Probst等[13]用抗RR陽(yáng)性患者血清與重組IMPDH2反應(yīng)，但效果不佳。原因有2點(diǎn)，首先，檢測(cè)患者血清中的RR抗體取決于所使用的商用抗核抗體玻片。迄今為止，大多數(shù)抗核抗體HEp-2玻片不具有可識(shí)別的RR結(jié)構(gòu)。另外，不是所有的抗體都能檢測(cè)到RR上的構(gòu)象表位，這可能是重組IMPDH2與天然IMPDH2的構(gòu)象和表位數(shù)量存在差異，使許多免疫熒光抗體無(wú)法識(shí)別RR。然而，所有抗體可以通過(guò)Western印跡檢測(cè)單體，而僅IMPDH2抗體通過(guò)免疫熒光能夠檢測(cè)到3/4的RR結(jié)構(gòu)。因此，用抗體檢測(cè)RR為陰性時(shí)，并不能排除RR結(jié)構(gòu)的存在。

4 HCV感染與自身免疫性抗體

慢性HCV感染者抗核抗體陽(yáng)性率為6%～22%，并且為低滴度(1∶40～1∶80)，平滑肌抗體陽(yáng)性率為10%～66%，抗肝腎微粒體抗體檢出率為10%[14-15]。其他抗體也可在HCV感染者中被檢出，但是目前尚不清楚是否與HCV感染有關(guān)，如抗唾液酸糖蛋白受體、抗肝細(xì)胞膜抗原、抗肝細(xì)胞質(zhì)溶膠抗原、抗肝細(xì)胞質(zhì)膜、抗甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶、抗甲狀腺微粒體、抗磷脂和抗中性粒細(xì)胞胞漿等[16]。

4.1 RR抗體與HCV感染的關(guān)系 最近，RR抗體在HCV感染者中的研究備受關(guān)注。目前尚不清楚RR自身抗體的具體臨床意義，但較為公認(rèn)的是RR抗體的出現(xiàn)與干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療丙型肝炎有關(guān)。Seelig等[17]利用放射免疫法首次證明了IMPDH2抗體在不同疾病中存在。IMPDH2抗體在攜帶HCV-RNA患者(35.2%，n=108)、抗肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性自身免疫性肝炎患者(31.0%，n=42)、HBV-DNA陽(yáng)性者(6.2%，n=113)、住院的HCV-RNA陰性患者(5.0%，n=100)、抗核抗體陽(yáng)性患者(13.7%，n=51)、原發(fā)性膽汁性肝硬化并且M2型抗線粒體抗體陽(yáng)性患者(3.2%，n=31)和健康人群(2.0%，n=100)中均有發(fā)現(xiàn)[17]。需要強(qiáng)調(diào)的是，放射免疫法并非檢測(cè)IMPDH2抗體最準(zhǔn)確的方法，并且有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性，但是可在一定程度上反映RR抗體與利巴韋林治療的關(guān)系。

美國(guó)健康和營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)調(diào)查無(wú)HCV肝炎史的患者4754例，其中0.8%呈RR抗體陽(yáng)性[18]。Stinton等[10]卻發(fā)現(xiàn)，健康人群和未經(jīng)治療的丙型肝炎患者體內(nèi)不存在RR抗體。但是，F(xiàn)eng等[19]在1例HCV陰性的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)RR抗體陽(yáng)性，這可能與狼瘡患者常常處于Ⅰ型干擾素的環(huán)境中有關(guān)。這表明IMPDH特異性抑制劑單獨(dú)或聯(lián)合內(nèi)源性干擾素可以促進(jìn)RR自身抗體形成。

有研究發(fā)現(xiàn)，利巴韋林可以誘導(dǎo)組織培養(yǎng)細(xì)胞形成RR[12]。Keppeke等[20]并未在單獨(dú)使用Peg-IFN-α或利巴韋林的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)RR抗體，但是Peg-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療HCV患者的RR抗體陽(yáng)性率為38%，并且無(wú)應(yīng)答或復(fù)發(fā)的患者比獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的患者具有較高的RR抗體。更重要的是，在聯(lián)合治療停藥后，患者體內(nèi)的RR抗體還可以保留6～12個(gè)月[21]。除此之外，抗RR自身抗體陽(yáng)性率可能與種族無(wú)關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，美國(guó)HCV感染人群中，無(wú)應(yīng)答和復(fù)發(fā)者的RR抗體滴度高于應(yīng)答者，而意大利復(fù)發(fā)者RR抗體滴度高于無(wú)應(yīng)答和應(yīng)答者[11]。

綜上所述，RR抗體在Peg-IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療后無(wú)應(yīng)答或者復(fù)發(fā)的HCV感染者體內(nèi)較為常見(jiàn)。但是，目前尚有許多問(wèn)題凾待解決，如RR的空間結(jié)構(gòu)及RR除了CTPS1和IMPDH2組成外，是否還有其他蛋白成分；利巴韋林在體外可以誘導(dǎo)RR的形成卻不能在體內(nèi)發(fā)揮同樣的效應(yīng)；檢查RR蛋白試劑的靈敏度有待進(jìn)一步提高等。除此之外，更應(yīng)關(guān)注RR蛋白的功能，尤其是棒狀和環(huán)狀蛋白的功能，希望其能成為HCV感染治療過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并指導(dǎo)臨床用藥。

[1]Hajarizadeh B,Grebely J,Dore GJ.Epidemiology and natural history of HCV infection[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2013,10(9):553-562.

[2]Halliday J,Klenerman P,Barnes E.Vaccination for hepatitis C virus:closing in on an evasive target[J].Expert Rev Vaccines,2011,10(5):659-672.

[3]Zhu YZ,Qian XJ,Zhao P,et al.How hepatitis C virus invades hepatocytes:the mystery of viral entry[J].World J Gastroenterol,2014,20(13):3457-3467.

[4]Najera I.Resistance to HCV nucleoside analogue inhibitors of hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase[J].Curr Opin Virol,2013,3(5):508-513.

[5]Simmonds P.Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on[J].J Gen Virol,2004,85(Pt 11):3173-3188.

[6]Heim MH,Thimme R.Innate and adaptive immune responses in HCV infections[J].J Hepatol,2014,61(Suppl 1):S14-25.

[7]Kim SR,El-Shamy A,Imoto S,et al.Prediction of response to pegylated interferon/ribavirin combination therapy for chronic hepatitis C genotype 1b and high viral load[J].J Gastroenterol,2012,47(10):1143-1151.

[8]Carcamo WC,Satoh M,Kasahara H,et al.Induction of cytoplasmic rods and rings structures by inhibition of the CTP and GTP synthetic pathway in mammalian cells[J].PLoS One,2011,6(12):e29690.

[9]Carcamo WC,Calise SJ,von Mühlen CA,et al.Molecular cell biology and immunobiology of mammalian rod/ring structures[J].Int Rev Cell Mol Biol,2014,308(1):35-74.

[10]Stinton LM,Myers RP,Coffin CS,et al.Clinical associations and otential novel antigenic targets of autoantibodies directed against rods and rings in chronic hepatitis C infection[J].BMC Gastroenterol,2013,19(13):50-59.

[11]Carcamo WC,Ceribelli A,Calise SJ,et al.Differential reactivity to IMPDH2 by anti-rods/rings autoantibodies and unresponsiveness to pegylated interferon-alpha/ribavirin therapy in US and Italian HCV patients[J].J Clin Immunol,2013,33(2):420-426.

[12]Thomas EC,Gunter JH,Webster JA,et al.Different characteristics and nucleotide binding properties of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) isoforms[J].PLoS One,2012,7(12):e51096.

[13]Probst C,Radzimski C,Bl?cker IM,et al.Development of a recombinant cell-based indirect immunofluorescence assay (RC-IFA) for the determination of autoantibodies against “rings and rods”-associated inosine-5′-monophosphate dehydrogenase 2 in viral hepatitis C[J].Clin Chim Acta,2013,418(16):91-96.

[14]Acay A,Demir K,Asik G,et al.Assessment of the Frequency of Autoantibodies in Chronic Viral Hepatitis[J].Pak J Med Sci,2015,31(1):150-154.

[15]Ferri C,Sebastiani M,Giuggioli D,et al.Hepatitis C virus syndrome:A constellation of organ-and non-organ specific autoimmune disorders,B-cell non-Hodgkin′s lymphoma,and cancer[J].World J Hepatol,2015,7(3):327-343.

[16]Yang DH,Ho LJ,Lai JH.Useful biomarkers for assessment of hepatitis C virus infection-associated autoimmune disorders[J].World J Gastroenterol,2014,20(11):2962-2970.

[17]Seelig HP,Appelhans H,Bauer O,et al.Autoantibodies against inosine-5′-monophosphate dehydrogenase 2-characteristics and prevalence in patients with HCV-infection[J].Clin Lab,2011,57(9/10):753-765.

[18]Satoh M,Chan EK,Ho LA,et al.Prevalence and sociodemographic correlates of antinuclear antibodies in the United States[J].Arthritis Rheum,2012,64(7):2319-2327.

[19]Feng X,Huang J,Liu Y,et al.Identification of interferon-inducible genes as diagnostic biomarker for systemic lupus erythematosus[J].Clin Rheumatol,2015,34(1):71-79.

[20]Keppeke GD,Nunes E,Ferraz ML,et al.Longitudinal Study of a Human Drug-Induced Model of Autoantibody to Cytoplasmic Rods/Rings following HCV Therapy with Ribavirin and Interferon-alpha[J].PLoS One,2012,7(9):e45392.

[21]Covini G,Carcamo WC,Bredi E,et al.Cytoplasmic rods and rings autoantibodies developed during pegylated interferon and ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C[J].Antivir Ther,2012,17(5):805-811.

△通訊作者,E-mail：zhangpingan@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.065

A

1672-9455(2015)23-3600-02

2015-04-25

2015-06-26)