戴 蕓，張 玨，喬 昀

(上海市中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科 200021)

?

·臨床探討·

手工法和全自動機(jī)器法查找結(jié)核桿菌效果比較

戴 蕓，張 玨，喬 昀△

(上海市中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科 200021)

結(jié)核分枝桿菌；抗酸染色；全自動染色機(jī)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌侵入人體后引起的一種慢性傳染性疾病，并具有較強(qiáng)的傳染性，中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，活動性肺結(jié)核患者數(shù)居世界第2位。每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍以上[1-2]?？顾崛旧ㄊ墙Y(jié)核桿菌細(xì)菌學(xué)檢查的常用方法，也是考核療效、評價(jià)治療效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)[3]。其特點(diǎn)為快速、簡便、實(shí)用，檢出時(shí)間短，對器械要求不高，一直被基層醫(yī)院使用，但該方法的染色溫度及時(shí)間不容易掌握，在開放空間進(jìn)行，有傳染風(fēng)險(xiǎn)。因此，準(zhǔn)確、快捷且安全的染色方法對于結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集本院2013年1月1日至2014 年6月30日門診及住院患者痰標(biāo)本共1 396份,其中確診為結(jié)核患者痰標(biāo)本346份，非結(jié)核患者痰標(biāo)本1 050份。所有標(biāo)本由患者清晨漱口后咳出的深部痰液，放置于無菌痰盒內(nèi)。按《中國結(jié)核病防治規(guī)劃涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》制作2張盡可能一致的涂片。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 全自動抗酸染色儀DL-DYE-ACID及原裝試劑，由珠海迪爾生物有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 染色液 由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，染液由石碳酸復(fù)紅溶液、酸性乙醇溶液、亞甲藍(lán)溶液組成,均在有效期內(nèi)使用。

1.2.3 其他 全新玻片、顯微鏡(Olympus CX21)、生物安全柜(STERILCKER GARO4)。

1.3 方法

1.3.1 選取上海市臨檢中心的陽性質(zhì)控片20張，各使用10張進(jìn)行手工染色和機(jī)器染色。

1.3.2 涂片 用接種環(huán)挑取適量痰液，制成20 mm×15 mm大小的厚膜涂片。每份標(biāo)本涂抹2張涂片,分別用于手工法與機(jī)器法染色。盡量使每份標(biāo)本的2張涂片在取痰部位、痰膜厚薄、痰膜大小一致。

1.3.3 手工染色 初染：將涂片置于染色架上滴加石碳酸復(fù)紅液蓋滿玻片靜置15 min。脫色：流水輕緩沖洗以沖去初染液,瀝出玻片上的水,滴加鹽酸乙醇脫色劑至痰膜無可視紅色為止。復(fù)染：流水輕緩沖洗以沖去脫色液,瀝出剩余的水,滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液染色30 s 后,流水輕緩沖洗沖去復(fù)染液。

1.3.4 自動染色 按儀器操作規(guī)定先觀察試劑充足情況，然后調(diào)節(jié)水壓，打開電磁閥沖水觀察水流狀況同時(shí)調(diào)節(jié)水流使噴水口的水流至轉(zhuǎn)盤而不濺起水花，且水流至噴水口時(shí)為線狀快掉落轉(zhuǎn)盤時(shí)為斷續(xù)水珠狀。再按機(jī)器順序及位置裝載玻片，在主操作界面上設(shè)置玻片數(shù)量，后按確定即進(jìn)入染色循環(huán)。完成后取下已染色的玻片放置在烤片機(jī)加熱槽中加熱固化以待鏡檢。

1.3.5 顯微鏡鏡檢及結(jié)果判斷 嚴(yán)格按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷檢驗(yàn)規(guī)程》和試劑說明書進(jìn)行。鏡檢結(jié)果報(bào)道如下，抗酸桿菌陰性:連續(xù)觀察300個不同視野,未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌?？顾釛U菌陽性(±)：報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù)為1～8條/300個視野?？顾釛U菌(+)為3～9條/100個視野,連續(xù)觀察300個視野?？顾釛U菌(++)為1～9條/10個視野,連續(xù)觀察100個視野?？顾釛U菌(+++)為1～9條/每個視野,連續(xù)觀察50個視野?？顾釛U菌(++++)為≥10條/每個視野,連續(xù)觀察50個視野。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自動染色機(jī)進(jìn)行質(zhì)控片染色結(jié)果 機(jī)器法染色效果見圖1，在藍(lán)色背景下可見清晰的紅色抗酸桿菌，染色效果較好。

圖1 全自動染色機(jī)染色效果

2.2 手工法與自動染色法陽性結(jié)果比較 見表1。由表1可見，全自動染色機(jī)法與手工法染色陽性結(jié)果在結(jié)核組與非結(jié)核組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 手工法與自動法染色陽性結(jié)果比較[n(%)]

2.3 手工法與自動法染色結(jié)果比較 見表2。由表2可見，全自動染色機(jī)法與手工法染色經(jīng)鏡檢各級結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 手工法與自動法染色各級結(jié)果比較(n)

3 討 論

長期以來，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要依賴涂片抗酸染色鏡檢、結(jié)核菌培養(yǎng)法及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等方法，但是，傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法細(xì)菌生長周期長(4～8周)易延誤患者病情與治療。熒光定量PCR技術(shù)雖然有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)勢，但是，此檢測方法對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作技術(shù)都有很高標(biāo)準(zhǔn)的要求,不利于基層結(jié)防控制機(jī)構(gòu)的工作。人工操作染色涂片也存在操作繁瑣、耗時(shí)長、不能標(biāo)準(zhǔn)化、難以質(zhì)控及浪費(fèi)染色液的問題，而且人工操作還存在一定的開放性傳染風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)有些報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室工作人員結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)為普通人群的7～79倍[4]。因此，準(zhǔn)確、快捷且安全的染色檢測方法對于結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療具有十分重要的意義。

全自動抗酸染色機(jī)具有較多優(yōu)點(diǎn)：(1)操作簡單，只要在主界面設(shè)置染片數(shù)量即開始染色循環(huán)且一次最多可以染8張涂片，利于基層實(shí)驗(yàn)室開展工作。(2)能定量加液模擬手工染色避免浪費(fèi)染色液，并且儀器內(nèi)置染色液能有效保護(hù)染色液。(3)采用“微量浸泡技術(shù)”，保證染液與涂片充分接觸，內(nèi)置獨(dú)特轉(zhuǎn)盤杜絕玻片之間交叉污染，同時(shí)低速脫水保護(hù)標(biāo)本不脫落。(4)在生物安全方面，自動染色機(jī)內(nèi)置染色液具備自動清洗功能，能防止儀器內(nèi)部污染，同時(shí)其封閉式染色系統(tǒng)減輕了結(jié)核菌對實(shí)驗(yàn)室工作人員的職業(yè)危害。(5)具備自動清洗功能，杜絕儀器內(nèi)部污染，保護(hù)儀器長期使用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,在用抗酸染色查找痰中結(jié)核桿菌時(shí),無論是陰性還是陽性痰標(biāo)本,手工法和自動法在檢測結(jié)果上其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示使用全自動抗酸染色機(jī)查找痰涂片中結(jié)核分枝桿菌在臨床診斷中具有一定臨床意義。但是同許多研究一樣，本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)痰涂片染色找抗酸桿菌的其敏感性太低，僅分別為30.92%和34.39%。這是因?yàn)榭顾崛旧芴抵屑?xì)菌數(shù)量限制，一般至少每毫升痰液含5 000～10 000個細(xì)菌方可得出陽性結(jié)果;且結(jié)核病患者是間斷性排菌，可能造成假陰性造成漏診[5-6]。另外干擾因素多，系統(tǒng)及人為引起的誤差大。

因此，在實(shí)驗(yàn)室允許的條件下，結(jié)合其他診斷方法有一定的臨床需要。

[1]Jasmer RM,Nahid P,Hopewell PC.Latent tuberculososis infection[J].N Engl J Med,2002,347(23):1860-1866.

[2]Lee E,Holzman RS.Evolution and current use of the tuberculintes[J].Clin Infect Dis,2002,34(3):365-370.

[3]劉卓然.三種方法聯(lián)合檢測肺結(jié)核病人痰液和支氣管刷洗物中結(jié)核桿菌的臨床意義[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15(6)：1938-1939.

[4]Joshi R,Reingold AL,Menzies D,et al.Tuberculosis among health-care workers in low-and middle-income countries:a systematic review[J].PLoS Med,2006,3(12):e494.

[5]徐蓉.熒光定量PCR 檢測結(jié)核桿菌DNA 與涂片抗酸染色結(jié)果的對照分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10(1)：62-63.

[6]戴佩佩.三種檢測方法對活動性結(jié)核病的臨床診斷價(jià)值[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21(7)：1748-1749.

△通訊作者，E-mail:qiaoyun1252@live.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.046

A

1672-9455(2015)23-3558-02

2015-03-18

2015-06-20)