蘭海霞，呼格吉樂，王艷艷△，高乃康

(1.解放軍第二五三醫(yī)院兒科，呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，呼和浩特 010050)

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·論 著·

人總MBP干擾RNA真核表達載體的構(gòu)建及MBP功能初步研究*

蘭海霞1，呼格吉樂2，王艷艷2△，高乃康3

(1.解放軍第二五三醫(yī)院兒科，呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，呼和浩特 010050)

目的 本研究構(gòu)建4個攜帶髓鞘堿性蛋白(MBP)公共序列的干擾RNA真核表達載體，并轉(zhuǎn)染人神經(jīng)膠質(zhì)細胞U251細胞，為研究MBP在新生兒腦損傷中的作用提供平臺。方法 (1)構(gòu)建4個攜帶新靶點的MBP干擾RNA真核表達載體，酶切后將酶切片段測序鑒定；(2)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將構(gòu)建的MBP干擾RNA真核表達載體轉(zhuǎn)入U251細胞株內(nèi)。結(jié)果 (1)成功構(gòu)建了4個攜帶新靶點的MBP干擾RNA真核表達載體；(2)在U251細胞中有綠色熒光蛋白表達，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測MBP干擾成功；(3)干擾U251細胞中MBP表達后，致使U251細胞生長變慢。結(jié)論 成功構(gòu)建攜帶新靶點的MBP干擾RNA真核表達載體，利用載體干擾MBP基因,結(jié)果表明MBP在U251細胞生長過程中起重要作用。

干擾RNA；髓鞘堿性蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)細胞U251；轉(zhuǎn)染

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)指新生兒圍生期發(fā)生窒息導致腦的缺氧缺血性損害，臨床出現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的表現(xiàn),是世界范圍內(nèi)新生兒圍生期死亡和后期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的重要原因。因此，對新生兒窒息早期診斷和早期治療是減少新生兒HIE發(fā)生、發(fā)展的必要手段[1-2]。但目前各國仍缺乏新生兒窒息早期診斷較靈敏、準確的指標，髓鞘堿性蛋白(MBP)是中樞神經(jīng)髓鞘膜的主要成分，起維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的作用。近年研究指出，血清MBP濃度升高可作為腦實質(zhì)性損傷及脫髓鞘改變的一項特異性生化指標，因此，MBP被臨床作為診斷、預測新生兒腦損傷的重要監(jiān)測指標。但目前MBP在體內(nèi)的作用機制還不清楚，因此本研究將構(gòu)建MBP干擾核糖核酸(RNA)真核表達載體,利用干擾RNA技術(shù)初步探討MBP的作用機制，為以后深入研究MBP在體內(nèi)的作用機制構(gòu)建平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤U251細胞株購自中科院上海細胞庫，脫氧核糖核酸(DNA)內(nèi)切酶、DNA連接酶等購自MBI公司，聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自Takara公司,DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖等購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 設計干擾RNA 短發(fā)夾RNA(shRNA)模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。反義鏈模板的5′端添加了GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補；正義鏈模板的5′端添加了CACC，與BbsI酶切后形成的黏端互補；如果siRNA的第一個堿基不是G，則在CACC后補加一個G。設計序列如下。pGPU6/GFP/Neo-MBP-1：GGA CTG TCC CTG AGC AGA TTT CAA GAG AAT CTG CTC AGG GAC AGT CCT T；pGPU6/GFP/Neo-MBP-2：GCA GAG CGT CCG ACT ATA AAT TTC AAG AGA ATT TAT AGT CGG ACG CTC TGC TT；pGPU6/GFP/Neo-MBP-3：GGC TGT GCA ACA TGT ACA AGG TTC AAG AGA CCT TGT ACA TGT TGC ACA GCC TT；pGPU6/GFP/Neo-MBP-4：GCG TAG TCC ACT TCT TCA AGA ATT CAA GAG ATT CTT GAA GAA GTG GAC TAC GTT。

1.2.2 退火 用TE(pH8.0)分別溶解DNA oligo至濃度100 μmoL,取正義鏈和反義鏈oligo溶液，進行退火反應。退火反應體系:10×反應緩沖液5 μL；上游引物5 μL；下游引物5 μL；加無菌去離子35 μL至總體積50 μL。在PCR儀上依照以下程序進行退火處理：95 ℃ 5 min;85 ℃ 5 min;75 ℃ 5 min;70 ℃ 5 min;4 ℃保存。退火后,將得到濃度為10 μmoL/L的shRNA模板稀釋50倍至終濃度為200 nmol/L，以用于連接反應。

1.2.3 載體線性化 取2 μg pGPU6/GFP/Neo載體，37 ℃酶切1 h，電泳檢測回收后估算濃度，稀釋至終濃度為50 ng/μL。

1.2.4 載體的構(gòu)建 將pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞JM109中，每個反應分別挑取5個菌落，接種到含50 μg/mL Kanamycin的LB培養(yǎng)基中，37 ℃孵育過夜。分別挑取過夜培養(yǎng)平板上單個菌落接種于5 mL含卡那霉素(30 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，250 g/min,振蕩培養(yǎng)12 h。提取質(zhì)粒后，分別將質(zhì)粒用BamH Ⅰ、Pst Ⅰ酶切鑒定，并測序。

1.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取出感受態(tài)細胞JM109，加入10 μL連接產(chǎn)物，將200 μL孵育后的細胞均勻涂布于含50 μg/mL Kanamycin LB平板上，將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)16 h。

1.2.6 陽性克隆的鑒定 在這幾個連接反應里挑選出5個菌落，孵育后使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，對所得質(zhì)粒用BamHⅠ、PstⅠ分別酶切鑒定。試驗所得陽性重組載體應該可以被BamHⅠ切開，而不能被PstⅠ切開。挑2個酶切結(jié)果符合的質(zhì)粒進行測序。采用高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(中量)對測序結(jié)果正確的菌株進行質(zhì)粒抽提。

1.2.7 干擾質(zhì)粒對U251細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將高純度的上述質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入U251細胞中,培養(yǎng)后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.8 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測MBP基因表達 本研究將轉(zhuǎn)入PGPU6/GFP/Neo-MBP-1細胞設為干擾組；未進行任何處理的細胞設為正常組；將轉(zhuǎn)入PGPU6/GFP空載體的細胞設為陰性對照組。3組各取108細胞鋪滿96孔板進行培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后收集細胞提取細胞總RNA，利用Takara公司PCR試劑盒進行RT-PCR，MBP上游引物為5′-CTA ATG CCT GCG GAG TTG TGC-3′；下游引物為5′-GTA GGC AGC GAA CAC CAG AA-3′。內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物為5′-CGG GAA ACT GTG GCG TGA T-3′，下游引物為5′-ACG CGA ATT CAG CTA ATT GGG G-T3′。PCR體系：Ex Taq DNA聚合酶12.5 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；模板1 μL；加無菌去離子水10.5 μL至總體積25 μL。在PCR儀上按照如下程序進行PCR：94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s;55 ℃ 30 s;72 ℃15 s;28個循環(huán)，4 ℃保存。對PCR產(chǎn)物進行電泳分析。

1.2.9 MTT法檢測細胞的增殖能力 每組設5個復孔，并設一組空白對照孔。取各組細胞，以4×103的細胞濃度接種于96孔板，分別在第1、2、3、4、5天每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT液，再培養(yǎng)4 h后，移去舊液，加入200 μL DMSO,振蕩10 min,用酶標儀檢測，然后計算并分析。

2 結(jié) 果

2.1 酶切結(jié)果 將提取質(zhì)粒進行酶切鑒定,陽性重組質(zhì)粒載體應該可以被BamH Ⅰ切開，而不能被Pst Ⅰ切開，結(jié)果表明本試驗構(gòu)建的4個質(zhì)粒均為陽性重組質(zhì)粒載體。

2.2 測序鑒定 分別從4組中選取2個克隆進行測序，鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建載體序列未發(fā)現(xiàn)突變、缺失、插入等異常，以PGPU6/GFP/Neo-MBP-1測序圖為例，見圖1。

圖1 PGPU6/GFP/Neo-MBP-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列結(jié)構(gòu)

2.3 倒置熒光顯微鏡觀察MBP干擾RNA真核表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果 在倒置熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染后的細胞，各組細胞都有綠色熒光蛋白表達，其中PGPU6/GFP/Neo-MBP-1組效果最明顯，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染PGPU6/GFP/Neo-MBP-1的細胞

2.4 RT-PCR檢測MBP基因表達 RT-PCR檢測MBP基因表達結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示干擾組MBP的條帶亮度明顯低于其他兩組，正常組與陰性對照組MBP的條帶亮度基本一致，說明干擾組MBP 的表達下調(diào)，干擾成功。

注：1為干擾組；2為正常組；3為陰性對照組。

圖3 MBP基因半定量結(jié)果

2.5 MBP干擾RNA對U251細胞生長的影響 PMBP-1-U251組細胞從第3天開始，細胞生長變慢，明顯低于PNC-siRNA-U251細胞和U251組細胞的生長速度。而PNC-siRNA-U251細胞和U251組細胞的生長速度差異不明顯，見圖4。

圖4 3組細胞生長速度

3 討 論

新生兒HIE是由于各種圍生期因素引起的缺氧和腦血流量減少或暫停而導致胎兒和新生兒腦損傷，是新生兒死亡和致殘的常見疾病,是新生兒窒息后的嚴重并發(fā)癥,也是導致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的常見原因之一[1-2]。因此，早期判斷腦損傷程度及有效的干預方法成為近年來國內(nèi)外研究的熱點。窒息引起的潛在性腦損傷是一個十分復雜的病理過程，涉及多種因子和信號傳導途徑，只有深入研究參與神經(jīng)損傷過程中的每個因子的作用及其相互關(guān)系，才能更細致地了解腦損傷的實質(zhì)，最終攻克神經(jīng)損傷后的早期診斷與治療的難題[3-4]。

MBP是少突膠質(zhì)細胞和雪旺細胞合成的一種強堿性膜蛋白，主要在少突膠質(zhì)細胞內(nèi)以共價鍵結(jié)合于髓鞘質(zhì)漿膜面，并與細胞骨架、微管、微絲相連，起維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的作用，其血清水平的增高是急性腦實質(zhì)損傷和脫髓鞘改變的特異性生化指標[3-6]。MBP基因7個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有不同的剪接方式，人腦中有至少5種不同的剪接產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)其對人腦發(fā)育、神經(jīng)細胞分化、髓鞘發(fā)生與髓鞘形成具有重要生理作用[7]。生理狀態(tài)下，腦組織中MBP水平很低，一般很難被檢測，當腦損傷病變累及髓鞘時，致使MBP發(fā)生崩解，并釋放入血液和腦脊液中，導致血液中MBP水平升高，并引起神經(jīng)功能障礙，說明體內(nèi)MBP水平變化能特異地反映髓鞘脫失程度進而反映神經(jīng)組織病損程度[5]。另有研究顯示，MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和急性脫髓鞘有效的生化指標，并可以作為判斷以顱腦傷為主多發(fā)傷患者腦挫傷病情嚴重程度和評估預后的指標[6-8]。

RNA干擾現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性dsRNA介導細胞內(nèi)的同源mRNA發(fā)生特異性降解，導致靶基因表達沉默，產(chǎn)生相應功能表型缺失。這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGS)機制，是存在于真核生物體內(nèi)的一種阻斷外源基因表達的自我防御體系。RNA干擾原理是將雙鏈RNA(dsRNA)裂解為21～25個核苷酸組成的小的小干擾RNA(siRNA)作為介導子，引起同源序列特異性的mRNA降解[9]。目前，使用RNA干擾技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，在基因功能的研究上呈現(xiàn)巨大的應用前景，提供了一種高通量分析途徑。這項技術(shù)已被廣泛應用于分子醫(yī)學研究的眾多領(lǐng)域：如多藥耐藥性[10]，抑制腫瘤的侵襲、增殖[11]，抗病毒感染疾病等研究[12]。

人胎腦中以21.5×103MBP表達為主，成年腦中以18.5×103MBP表達最多，提示MBP在體內(nèi)不同組織、不同時期有其他的表達。此前研究利用RNA干擾對MBP進行研究，所干擾的靶點是針對21.5×103的MBP[13]。本文對基因庫中所有人的MBP cDNA序列進行比對分析，查找MBP cDNA序列的共同序列，參考MBP的公共cDNA上找到4個新的可能高效干擾MBP mRNA的靶點，經(jīng)人工合成，隨后分別構(gòu)建MBP干擾RNA真核表達載體，分別將載體轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞中，每個連接反應挑取5個菌落，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamH Ⅰ、Pst Ⅰ分別酶切鑒定，所有構(gòu)建載體均為陽性重組載體，測序結(jié)果表明構(gòu)建的干擾載體序列與設計序列完全相同，說明4個MBP干擾RNA真核表達載體均構(gòu)建成功。本研究分別提取構(gòu)建成功的質(zhì)粒并與LipofectamineTM2000結(jié)合進行轉(zhuǎn)染，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染后的細胞，各組細胞都有綠色熒光蛋白表達，其中PGPU6/GFP/Neo-MBP-1組效果最明顯；同時利用RT-PCR檢測MBP基因在細胞中的表達，結(jié)果顯示干擾組MBP表達下調(diào)，干擾成功。本研究利用MTT法檢測細胞的增殖能力，生長試驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)MBP 的表達使U251細胞的生長明顯減慢。

總之，本研究成功構(gòu)建人MBP的真核表達載體，利用RNA干擾技術(shù)干擾MBP的表達，從而抑制了U251細胞生長。說明MBP在U251細胞生長過程中起重要作用，為進一步研究MBP對人腦神經(jīng)質(zhì)細胞的影響奠定了試驗基礎(chǔ)，也為MBP在新生兒腦損傷中的作用提供試驗平臺和有價值的資料。

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Construction and preliminary function study of the interfering RNA eukaryotic expression vectors of human MBP gene*

LANHai-xia1,Hugejile2,WANGYan-yan2△,GAONai-kang3

(1.DepartmentofPediatrics,the253thHospitalofPLA,Hohhot,InnerMengolia010051,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHospitalofInnerMengoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMengolia010050,China;3.DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofInnerMengoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMenglia010050,China)

Objective To construct the the interfering RNA eukaryotic expression vectors carrying four common subsequencehumans of human myelin basic protein (MBP) gene,and to transfer them into human U251 glioma cells,so as to provide a platform for the research of the role of MBP in neonatal brain injury.Methods (1)To construct four interfering RNA eukaryotic expression vectors carrying new targets of human MBP gene,and to identify their sequences after enzyme digestion.(2)To transfer the contructed vectors into human U251 glioma cells via via oligofectamine.Results (1)Four interfering RNA eukaryotic expression vectors carrying new targets of human MBP gene were successfully contructed.(2)Green fluorescent protein expressed in human U251 glioma cells were successfully detected,and RT-PCR result showed MBP was interfered successfully.(3)The growth of human U251 glioma cells was retarded after MBP being interfered.Conclusion The interfering RNA eukaryotic expression vectors carrying new targets of human MBP gene have been successfully conducted and used to interfere the MBP gene,which means MBP plays a important role in the growth of human U251 glioma cells.

interfering RNA；myelin basic protein；U251 glioma cells；transfection

內(nèi)蒙古科技廳應用技術(shù)研究與開發(fā)資金資助項目(20120406)；內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃資助項目(201303062)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校科學技術(shù)研究重大資助項目(NJZZ13411)；內(nèi)蒙古自然基金面上資助項目(2012MS1147)。

蘭海霞，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒科及分子生物學研究?！?/p>

，E-mail：wangyanyan8311@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.008

A

1672-9455(2015)23-3469-03

2015-04-02

2015-06-12)