朱云鳳，高 峰，張春兵△

(1.江蘇省張家港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 215600;2.江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210029)

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·論 著·

川芎嗪對(duì)過(guò)氧化氫引起PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

朱云鳳1，高 峰2，張春兵2△

(1.江蘇省張家港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 215600;2.江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210029)

目的 分析川芎嗪預(yù)處理大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞后過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，探討川芎嗪抑制腦缺血損傷中氧自由基損傷的分子機(jī)制。方法 采用川芎嗪預(yù)處理PC12細(xì)胞后，制備過(guò)氧化氫細(xì)胞損傷模型，采用CCK-8法活細(xì)胞檢測(cè)、Hoechst-33342染色、流式細(xì)胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制。結(jié)果 應(yīng)用0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L濃度川芎嗪預(yù)處理后，細(xì)胞活力分別為(51.2±4.64)%、(58.5±7.46)%、(73.8±2.94)%、(81.0±6.06)%(F=146.9，P<0.05)，細(xì)胞未見(jiàn)大量凋亡小體形成，Bax/Bcl-2比值降低(F=2.14，P<0.05)，線(xiàn)粒體膜電位提高，Caspase 3、9活性降低(Caspase 3：F=1.59，P<0.05；Caspase 9：F=4.98，P<0.05)。結(jié)論 川芎嗪預(yù)處理后可降低過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，抑制氧自由基損傷。

川芎嗪；PC12細(xì)胞；腦缺血損傷；凋亡

氧自由基損傷機(jī)制是腦缺血損傷中較早提出的學(xué)說(shuō)，正常情況下體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)急性腦梗死時(shí)，由于缺血造成供氧不足和三磷酸腺苷(ATP)合成減少，平衡狀態(tài)遭到破壞，氧自由基積聚蓄積而造成腦損傷[1]。前期研究及其他試驗(yàn)報(bào)道，川芎嗪可以穿透血腦屏障，降低缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)元的凋亡[2-4]。本研究擬以PC12細(xì)胞株為研究對(duì)象，制備過(guò)氧化氫細(xì)胞損傷模型，觀察不同濃度川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，探討川芎嗪抑制氧自由基損傷的可能機(jī)制，進(jìn)而明確川芎嗪減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆株P(guān)C12購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、馬血清、DMEM培養(yǎng)基(新西蘭Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Difco公司)；明膠(美國(guó)Sigma公司)；鹽酸川芎嗪注射液：40 mg/2 mL(江蘇省無(wú)錫市第七制藥廠)；Hoechst-33342，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；羅丹明(美國(guó)Invitrogen公司)；Active Caspase 3 Staining Kit，Active Caspase 8 Staining Kit和Active Caspase 9 Staining Kit(美國(guó)Biovision公司)；PrimescriptTM反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)Kit、Trizol(大連寶生物公司)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；IX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 采用0.1%明膠預(yù)包被培養(yǎng)瓶，備用。用完全培養(yǎng)液(含10%滅活馬血清和10%滅活胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，葡萄糖濃度：4.5 g/L，pH:7.4)于5%CO2、37 ℃環(huán)境常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞。細(xì)胞融合率達(dá)70%時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液，用移液器將細(xì)胞吹散，以1∶4的比例進(jìn)行傳代，常規(guī)培養(yǎng)2 d后，半量培養(yǎng)液換液。

1.3 過(guò)氧化氫模型制備[5]采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，105細(xì)胞/孔，100 μL完全培養(yǎng)液，隔天換液，生長(zhǎng)至單層。加入200 mmol/L過(guò)氧化氫，孵育24 h，去除培養(yǎng)基；換上不含過(guò)氧化氫的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，復(fù)孔培養(yǎng)。

1.4 川芎嗪保護(hù)試驗(yàn) 生理鹽水配制川芎嗪成0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L 4種梯度濃度，預(yù)處理PC12細(xì)胞，孵育60 min后，去除培養(yǎng)基；洗滌，換液，并加入200 mmol/L過(guò)氧化氫，孵育24 h，去除培養(yǎng)基；換上不含過(guò)氧化氫的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，復(fù)孔培養(yǎng)。按照CCK-8試劑說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞活力；選取0.0 mmol/L和1.0 mmol/L川芎嗪預(yù)處理組含有細(xì)胞單層的玻片，進(jìn)行Hoechst-33342染色觀察(熒光顯微鏡400×，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

1.5.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L 4種濃度川芎嗪保護(hù)試驗(yàn)后，取培養(yǎng)細(xì)胞(105細(xì)胞)，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度，取A260/280在1.8～2.0的標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。按照PrimescriptTMRT-PCR 試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，-20 ℃貯存。

1.5.2 探針及引物 采用Primer Express 3.0跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物、探針，委托上海英駿合成，探針5′標(biāo)記FAM發(fā)光基團(tuán)，3′標(biāo)記ECLIPSE淬滅基團(tuán)。Bcl-2(序列號(hào)為NM_016993，片段為74 bp，TM為52 ℃)上游引物:5′-TGCGCTCAGCCCTGTG-3′，下游引物:5′-GGTAGCGACGAGAGAAGTCATC-3′，探針:5′-CCACCTGTGGTCCACCTG-3′；Bax(序列號(hào)為NM_017059，片段為74 bp，TM為52 ℃)上游引物:5′-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3′，下游引物:5′-CAATCATCCTCTGCAGCTCCATATT-3′，探針:5′-CCAGTTCATCTCCAATTCG-3′；GAPDH(序列號(hào)為NM_017008，片段為120 bp，TM為52 ℃)上游引物:5′-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物:5′-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3′，探針:5′-TTCCGCTGATGCCCC-3′。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR反應(yīng)體系25 μL，包括cDNA 2 μL，2×Premix EX Taq 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針 1 μL，去離子水8.5 μL；取103、104、105、106copy/mL 4種濃度梯度含擴(kuò)增片段重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品。PCR參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性45 s；95 ℃變性5 s，52 ℃退火、延伸35 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在52 ℃退火、延伸步驟采集熒光信號(hào)，并繪制相關(guān)曲線(xiàn)，分析標(biāo)本擴(kuò)增數(shù)據(jù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

1.6.1 檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位 在0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L 4種濃度川芎嗪保護(hù)試驗(yàn)后，加入羅丹明123染液5 μg/mL；37 ℃、5%CO2孵育15 min；采用完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次；重懸，37 ℃、5%CO2孵育60 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

1.6.2 檢測(cè)細(xì)胞Caspase活性 在0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L 4種濃度川芎嗪保護(hù)試驗(yàn)后，每組取300 μL細(xì)胞懸液(105細(xì)胞/100 μL)，加入Caspase 3、8、9底物FITC-DEVD-FMK 1 μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(加入Caspase抑制物Z-VAD-FMK 1 μL)。37 ℃、5%CO2孵育30 min，緩沖液洗滌2次后，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

2 結(jié) 果

2.1 川芎嗪增強(qiáng)細(xì)胞活性 過(guò)氧化氫具有細(xì)胞毒性。應(yīng)用0.0、0.1、1.0、10.0 mmol/L 4種濃度的川芎嗪處理過(guò)氧化氫(200.0 μmol/L)PC12細(xì)胞模型，細(xì)胞活力分別為(51.2±4.64)%、(58.5±7.46)%、(73.8±2.94)%、(81.0±6.06)%，川芎嗪呈劑量依賴(lài)性提高細(xì)胞存活率，降低過(guò)氧化氫神經(jīng)細(xì)胞毒性(與0.0 mmol/L組比較F=146.9，P<0.05)。

2.2 川芎嗪抑制核固縮及凋亡小體產(chǎn)生 過(guò)氧化氫(200.0 μmol/L)模型中，PC12細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，凋亡小體形成。1.0 mmol/L川芎嗪預(yù)處理組，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度均勻一致，未見(jiàn)大量凋亡小體(圖1)。

圖1 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及川芎嗪保護(hù)效應(yīng)-Hoechst 33342染色(×400)

2.3 川芎嗪調(diào)控Bax/Bcl-2通路抑制細(xì)胞凋亡 過(guò)氧化氫模型組Bax/Bcl-2顯著升高(與0.0 mmol/L組比較，F(xiàn)=1.31，P<0.05)；川芎嗪預(yù)處理后，Bax/Bcl-2呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性降低(與1.0 mmol/L組比較，F(xiàn)=2.14，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 過(guò)氧化氫模型中Bax和Bcl-2拷貝數(shù)

注：0組表示0.0 mmol/L川芎嗪+0.0 μmol/L過(guò)氧化氫；1組表示0.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；2組表示0.1 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；3組表示1.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；4組表示10.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫。與0組比較，#P<0.05；與1組比較，*P<0.05。

2.4 川芎嗪拮抗過(guò)氧化氫破壞線(xiàn)粒體膜電位 過(guò)氧化氫模型組，可見(jiàn)熒光顯著增強(qiáng)，表明線(xiàn)粒體膜電位下降；而經(jīng)過(guò)川芎嗪預(yù)處理后，熒光強(qiáng)度減弱，亦可觀察到劑量依賴(lài)性，表明川芎嗪可以劑量依賴(lài)性提高線(xiàn)粒體膜電位，抑制PC12細(xì)胞凋亡。

2.5 川芎嗪抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 過(guò)氧化氫刺激PC12細(xì)胞Caspase 3和Casapse 9活化(與0組比較，Caspase 3：F=3.74，P<0.05；Casapse 9：F=7.68，P<0.05)，未見(jiàn)Caspase 8活化；川芎嗪預(yù)處理后，Caspase 3和Caspase 9活性降低(與1組比較，Caspase 3：F=1.59，P<0.05；Caspase 9F=4.98，P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性；Caspase 8活性未見(jiàn)顯著降低(表2)。說(shuō)明調(diào)控通過(guò)Caspase 9和Caspase 3，而不是Caspase 8和Caspase 3途徑。

表2 川芎嗪調(diào)控過(guò)氧化氫模型組Caspase活性

注：0組表示0.0 mmol/L川芎嗪+0.0 μmol/L過(guò)氧化氫；1組表示0.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；2組表示0.1 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；3組表示1.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫；4組表示10.0 mmol/L川芎嗪+200.0 μmol/L過(guò)氧化氫。與0組比較，#P<0.05；與1組比較，*P<0.05。

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是多種機(jī)制參與的一種復(fù)雜病理生理過(guò)程，主要與自由基累積、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎性反應(yīng)等多種機(jī)制有關(guān)。自由基具有很高的化學(xué)活性，可快速攻擊其他化合物的分子并產(chǎn)生更多的自由基，破壞膜結(jié)構(gòu)中蛋白成分、引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致膜損傷、線(xiàn)粒體功能障礙、溶酶體破裂、細(xì)胞溶解和組織水腫等一系列損傷作用。大量研究表明，自由基可以作用于大量的分子目標(biāo)，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶、有絲分裂激活蛋白激酶、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Caspase家族[6]。

Bcl-2/Bax相對(duì)水平大致反映了細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能性，研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察了Bax/Bcl-2水平，發(fā)現(xiàn)川芎嗪預(yù)處理后，Bax/Bcl-2可呈劑量依賴(lài)性降低，相關(guān)蛋白主要是通過(guò)作用于線(xiàn)粒體來(lái)實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)凋亡或抑制凋亡的生物學(xué)活性[7-8]。線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起樞紐作用。線(xiàn)粒體跨膜電位降低是細(xì)胞凋亡早期的不可逆事件，線(xiàn)粒體是多種促細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點(diǎn)，同時(shí)也是細(xì)胞死亡通路的整合元件。本研究觀察到過(guò)氧化氫模型組，線(xiàn)粒體膜電位下降，而川芎嗪可抑制鈣超載，提高線(xiàn)粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡。Bax可活化同源半胱氨酸酶Caspase，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。活化的Caspase可以次序激活其他Caspase形成Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，Caspase8和Caspase9則分別參與死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線(xiàn)粒體損傷的內(nèi)源性途徑，是凋亡發(fā)生的啟動(dòng)者。本研究結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫主要通過(guò)內(nèi)源性途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，川芎嗪可以抑制Caspse3和Casapse9的活化，從而緩解凋亡進(jìn)程。

本研究結(jié)果表明，過(guò)量氧自由基可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，在合適濃度川芎嗪干預(yù)下，可呈劑量依賴(lài)性抑制細(xì)胞凋亡，其可能途徑為通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2平衡，進(jìn)而抑制Caspase3和Caspase9活化，提升線(xiàn)粒體膜電位發(fā)揮作用。

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Study on tetramethylpyrazine protecting PC12 cells from injury induced by H2O2*

ZHUYun-feng1,GAOFeng2,ZHANGChun-bing2△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhangjiagang,Jiangsu215600,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,JiangsuProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing，Jiangsu210029，China)

Objective To analyze the protection of tetramethylpyrazine to PC12 cells from apoptosis induced by H2O2and to explore the inhibition mechanisms of oxygen free radical injury in cerebral ischemia.Methods After the PC12 cells were pretreated by tetramethylpyrazine，H2O2was added to induce the apoptosis of PC12 cells.Various methods，including CCK-8 live cell test，Hoechst-33342 staining，flow cytometry and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)，were used to analyze the mechanisms involved in the process.Results After the different concentrations (0，0.1，1，10 mmol/L) tetramethylpyrazine pretreatment,there were no large number of apoptotic bodies formed in PC12 cells and the viability(%)of PC12 cells were (51.2±4.64)%,(58.5±7.46)%,(73.8±2.94)% and (81.0±6.06)% respectively(F=146.9，P<0.05).Moreover,in PC12 cells,the rate of Bax/Bcl-2 dropped(F=2.14，P<0.05),the electric potential of mitochondrial membrane enchanced,activity of Caspase 3 and Caspase 9 decreased(Caspase 3：F=1.59，P<0.05；Casapse 9：F=4.98，P<0.05).Conclusion The pretreatment with tetramethylpyrazine could reduce the apoptosis of PC12 cells damaged by H2O2and inhibit oxygen free radical injury.

tetramethylpyrazine；PC12 cells；cerebral ischemia injury；apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171659)。

朱云鳳，女，本科，副主任技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)工作?！?/p>

，E-mail:723932541@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.002

A

1672-9455(2015)23-3453-03

2015-03-20

2015-06-18)