劉運(yùn)端(廣西壯族自治區(qū)玉林市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科 537000)

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脂聯(lián)素及其基因多態(tài)性與某地冠心病的相關(guān)性研究

劉運(yùn)端(廣西壯族自治區(qū)玉林市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科 537000)

目的 探討某地瑤族冠心病(CHD)患者血清脂聯(lián)素(APN)水平及其基因位點(diǎn)+45 T/G和-11377 C/G的多態(tài)性與該地區(qū)瑤族健康者、漢族CHD患者、漢族健康者的差異。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測(cè)瑤族CHD患者、瑤族健康者、漢族CHD患者和漢族健康者(各100例)血清APN水平；使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè) APN 基因位點(diǎn)+45T/G和-11377C/G的多態(tài)性。結(jié)果 (1)2組CHD患者血清APN水平明顯低于2組健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。2組CHD患者血清APN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.076)。(2)在H-W平衡檢驗(yàn)中,4組研究對(duì)象APN基因位點(diǎn)+45T/G和-11377C/G均有群體代表性(均P>0.05)。(3)瑤族CHD患者ANP+45TG、GG基因型頻率均高于瑤族健康者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；漢族CHD患者ANP+45 基因型等位基因頻率略高于瑤族CHD患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)CHD患者ANP-11377 基因型和等位基因頻率與同民族健康者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瑤族CHD患者APN-11377基因雜合程度略低于漢族CHD患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 血清低APN水平和APN-11377位點(diǎn)是瑤族CHD患者的危險(xiǎn)因素，與漢族CHD患者相同。

脂聯(lián)素； 基因多態(tài)性； 瑤族； 冠心病

冠心病(CHD)是由冠狀動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管狹窄、供血不足，心肌缺血、缺氧而導(dǎo)致的心臟病，是致死致殘率較高的疾病之一。目前，我國(guó)CHD發(fā)病率有升高、發(fā)病年齡有提前的趨勢(shì)。CHD是由遺傳因素、環(huán)境因素和不良生活習(xí)慣相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，其中易感基因可能對(duì)CHD的發(fā)生起非常重要的作用。脂聯(lián)素(APN)是由脂肪細(xì)胞特異性分泌的活性因子，具有抗炎性、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集等生物作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)APN 所在基因區(qū)域與心血管疾病相關(guān)，且基因多態(tài)性具有地區(qū)、種族的特異性。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)廣西瑤族CHD患者APN 水平及其基因位點(diǎn)+45 T/G和-11377C/G 基因多態(tài)型及等位基因的分布頻率，探討APN水平及2個(gè)基因位點(diǎn)與廣西瑤族CHD的關(guān)系，從而為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 瑤族CHD患者、瑤族健康者、漢族CHD患者和漢族健康者，各100例?，幾錍HD患者(瑤族CHD組)：男53例，女47例，年齡49～75歲，平均年齡58.3歲。瑤族健康者(瑤族健康對(duì)照組)：男52例，女48例，年齡44～71歲，平均年齡56.9歲。漢族CHD患者(漢族CHD組)：男55例，女45例，年齡46～78歲，平均年齡57.5歲。漢族健康者(漢族健康對(duì)照組)：男54例，女46例，年齡47～69歲，平均年齡58.1歲?，幾迦脒x標(biāo)準(zhǔn)：(1)居住在廣西瑤族主要分布區(qū)的瑤族個(gè)體。(2)3代中未有與外族通婚的瑤族家族，選擇第3代個(gè)體為研究對(duì)象，且盡可能確保研究對(duì)象在其可追蹤的歷史上沒(méi)有與外族通婚。(3)無(wú)遺傳性疾病家族史及其他急、慢性疾病史。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：選擇冠狀動(dòng)脈造影顯示左主干狹窄大于或等于30%或其他3支至少有1支冠狀動(dòng)脈狹窄大于或等于50%者?，幾錍HD患者須符合上述2個(gè)入選標(biāo)準(zhǔn)，且動(dòng)態(tài)心電圖ST段下移。4組研究對(duì)象的年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。采樣過(guò)程遵循知情同意原則，通過(guò)詢問(wèn)確保樣本間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 標(biāo)本采集 抽取所有研究對(duì)象的靜脈血4 mL，分別注入干燥管和 EDTA抗凝管中，并充分混勻。30 min后，干燥管3 000 r/min,離心10 min，分離血清-20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測(cè)血清APN水平，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。EDTA管用于APN基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)。

1.3 儀器與試劑 9700擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)；電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(珠海黑馬生物公司)。APN試劑(美國(guó)GBD公司提供)；DNA 抽提試劑(深圳益生堂生物有限公司)。

1.4 DNA制備 采用離心柱法，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后將DNA 溶于TE 緩沖液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 APN基因檢測(cè) (1)反應(yīng)體系：在50 μL總體積中進(jìn)行，每孔反應(yīng)體系內(nèi)含8 μL PCR混合反應(yīng)液(含d NTP、buffer)、Taq酶0.5 μL、無(wú)菌水37.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模版2 μL，充分混勻。(2)APN基因位點(diǎn)+45 擴(kuò)增條件和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。取PCR后產(chǎn)物20 μL、BspHI 內(nèi)切酶1 μL，buffer 3 μL，無(wú)菌水6 μL，37 ℃ 環(huán)境酶切1 h。APN+45 (T/G) PCR產(chǎn)物為745 bp，酶切后為291 bp 和454 bp的2個(gè)片段(G等位基因)。在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，電壓100 V，電泳60 min后自動(dòng)凝膠圖像分析儀觀察電泳結(jié)果并攝像保存。(3)APN基因位點(diǎn)-11377 擴(kuò)增條件和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物20 μL、AlwNI 內(nèi)切酶1 μL，buffer 3 μL，無(wú)菌水6 μL，37 ℃ 酶切1 h。SNP-11377C/G的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為450 bp(C等位基因),酶切后為95 bp和355 bp(G等位基因)2個(gè)片段。在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，電壓100 V，電泳30 min后自動(dòng)凝膠圖像分析儀觀察電泳結(jié)果并攝像保存。見(jiàn)表1。

表1 APN+45和-11377基因位點(diǎn)引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同民族間和CHD組間的APN水平比較使用t檢驗(yàn)；APN等位基因進(jìn)行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)；4組間APN基因頻率分布的差異，采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組研究對(duì)象血清APN水平結(jié)果比較 瑤族CHD組患者血清APN水平明顯低于瑤族健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。漢族CHD組患者APN水平也顯著低于漢族健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?，幾錍HD組患者血清APN水平略高于漢族CHD組患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組研究對(duì)象血清APN水平結(jié)果比較

注：與同民族健康對(duì)照組比較，*P<0.05;△P<0.05。

2.2 4組APN基因分型結(jié)果比較 野生型是2組健康對(duì)照者APN+45和-11377位點(diǎn)的主要型別，APN+45和-11377基因位點(diǎn)雜合程度最高的是漢族CHD組患者。經(jīng)H-W平衡檢驗(yàn),比較觀察值和期望值,4組APN 2個(gè)位點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),符合H-W 群體遺傳平衡法則，具有群體代表性。見(jiàn)表3。

2.3 4組研究對(duì)象APN+45基因多態(tài)性的結(jié)果比較 使用卡方檢驗(yàn)比較4組研究對(duì)象APN+45等位基因頻率,提示漢族CHD組TG和GG基因頻率明顯高于漢族健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.122，P=0.017)；瑤族CHD組TG和GG基因頻率明顯高于瑤族健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.121；P=0.077)；瑤族CHD組APN+45基因雜合程度也略低于漢族CHD組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.750；P=0.417)。見(jiàn)圖1。

注：M:marker；1、2：TT型；3：TG型；4：GG型。

圖1 APN基因+45位點(diǎn)T/G 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳圖

2.4 4組APN-11377基因多態(tài)性的比較 4組研究對(duì)象APN-11377基因多態(tài)性分布顯示，2組CHD患者的等位基因頻率明顯高于2組健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.522，P=0.002；χ2=17.275；P=0.000)；瑤族CHD組患者APN-11377基因雜合程度也略低于漢族CHD組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.363，P=0.834)。見(jiàn)圖2。

注：M:marker;1：CG型；2、3：CC型；4、5：GG型。

3 討 論

APN是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有抗炎性、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、由脂肪組織特異性分泌的活性因子?？赏ㄟ^(guò)自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌方式影響葡萄糖轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮功能、炎性反應(yīng)和胰島素抵抗。APN對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用機(jī)制可能為:(1)抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[2]。(2)通過(guò)環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A途徑發(fā)揮抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[3]。(3)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[4]。(4)促進(jìn)肝臟合成高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)而發(fā)揮膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能、抗氧化功能和抗炎性等作用[5]。(5)通過(guò)對(duì)血管舒張因子一氧化氮(NO)增強(qiáng)血管舒張、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞黏附以及血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用，從而對(duì)血管系統(tǒng)起保護(hù)作用[6]。李長(zhǎng)江等[7]研究表明,APN通過(guò)抑制血管壁黏附分子的表達(dá)，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的目的。APN還通過(guò)上調(diào)泡沫細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1表達(dá)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，分解發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[8]。APN基因位于人染色體3q27區(qū)域，該區(qū)域包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，具有豐富的多態(tài)性，也是2型糖尿病、代謝綜合征、CHD的易感基因區(qū)域[9-12]。但APN基因SNP 在不同種族、地區(qū)分布差異較大,以致于國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果不一致,甚至對(duì)同一種族不同地區(qū)人群的研究也會(huì)有不同結(jié)果[13]。

本研究結(jié)果表明，與瑤族健康對(duì)照組比較，瑤族CHD組和漢族CHD組血清APN水平顯著降低，這與Kizer等[14]和徐麗等[15]的研究結(jié)果相似，證實(shí)血清低APN水平可能是CHD的危險(xiǎn)因素?，幾錍HD組APN水平略高于漢族CHD組，這可能跟瑤族CHD組體質(zhì)量指數(shù)略低于漢族CHD組相關(guān)。APN+45基因比較，瑤族CHD組和漢族CHD組APN+45的T/G、G/G基因型明顯高于瑤族健康對(duì)照組，雖然瑤族CHD組與瑤族健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，原因可能與實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少有關(guān)。等位基因頻率顯示G等位基因在廣西地區(qū)CHD患者中較多見(jiàn)，提示攜帶SNP+45G基因型更易發(fā)展為CHD，是CHD的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與國(guó)內(nèi)外研究相似[9，14]。對(duì)APN-11377基因進(jìn)行比較，瑤族CHD組和漢族CHD組APN-11377基因雜合程度明顯區(qū)別于瑤族健康對(duì)照組，提示APN-11377 基因多態(tài)性與CHD相關(guān)，也是CHD的一個(gè)危險(xiǎn)因素。2組CHD患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示APN-11377是該地區(qū)瑤族和漢族CHD的易感基因。

綜上所述，血清低APN水平和APN-11377基因位點(diǎn)是廣西地區(qū)漢族、瑤族CHD患者的易感因素。APN+45基因位點(diǎn)是否是瑤族CHD的易感基因，還需增加樣本量作進(jìn)一步研究。

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Study on relations between adiponectin and its gene polymorphism and Yao coronary heart disease of Guangxi district

LIUYun-duan

(DepartmentofLaboratory,YulinRedCrossHospitalinGuangxiDistrict，Yulin,Guangxi537000，China)

Objective To investigate the difference of serum levels of adiponectin and its gene polymorphism in Yao patients with CHD of Guanxi district and Han CHD patients and Yao normal people in same region．Methods The levels of serum adiponectin in Yao CHD patients,Han CHD patients,Yao normal people and Han normal people(each of 100 cases)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method,and APN+45 and APN-11377 genotyping were conducted by using PCR-RFLP.Results The levels of adiponectin in two groups of CHD patients were significantly lower than same race normal group,the difference were statically significant (P=0.000；P=0.000).The adiponectin levels of two CHD groups was not statically significant difference (P=0.067);(2) The APN+45 and APN-11377 of four groups conform the Hardy-Weinberg population genetic equilibrium law (allP>0.05);(3)The TG and GG genotype frequency of APN+45 In two CHD groups were higher than same race normal group,but the difference of Yao CHD group and Yao normal group was no statically significant(χ2=8.122，P=0.017;χ2=5.121；P=0.077),and the difference of Yao CHD group and Han CHD group were not statically significant(χ2=1.750；P=0.417);(4) The CG and GG genotype frequency of APN-11377 in two CHD groups were higher than same race normal group,the difference of Yao CHD group and Yao normal group was statically significant(χ2=12.522，P=0.002；χ2=17.275；P=0.000),and the difference of Yao CHD group and Han CHD group were not statically significant(χ2=0.363；P=0.834).Conclusion As with Han CHD patients,serum low APN level and APN-11377 loci may be risk factors of Yao CHD patients.

adiponectin; polymorphism; Yao nationality; coronary heart disease

劉運(yùn)端，男，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.029

A

1672-9455(2015)11-1567-03

2014-12-20

2015-02-10)