吳麗紅，儲(chǔ)忠英，劉惠軍（上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海201600）

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HPLC-DAD 法同時(shí)測(cè)定肝八味膠囊中4種成分的含量

吳麗紅，儲(chǔ)忠英，劉惠軍（上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海201600）

目的用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定肝八味膠囊中4種成分的含量。方法采用HPLC法，色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；流速1.0 m l／min。結(jié)果丹酚酸B對(duì)照品在15.026～100.17μg／m l范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為96.6%（n＝6），RSD＝1.8%（n＝6）；芍藥苷對(duì)照品在14.335～95.564μg／m l范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.0%（n＝6），RSD＝1.7%（n＝6）；虎杖苷對(duì)照品在8.235～54.90μg／m l范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.2%（n＝6），RSD＝1.8%（n＝6）；大黃素對(duì)照品在1.582 5～10.55μg／m l范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為98.1%（n＝6），RSD＝1.7%（n＝6）。結(jié)論此法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、陰性對(duì)照無(wú)干擾，適用于肝八味膠囊的質(zhì)量控制。

肝八味膠囊；高效液相色譜法；丹酚酸B；芍藥苷；虎杖苷；大黃素

肝八味膠囊［1］是上海方心制藥科技有限公司生產(chǎn)，由丹參、白芍、虎杖、穿山甲、鱉甲、三七、雞內(nèi)金、發(fā)酵蟲草菌絲粉等八味藥材組成，其中丹參、白芍、虎杖是主藥，具有活血散結(jié)、利濕解毒、滋陰養(yǎng)肝之功效，起重要治療作用。原制劑標(biāo)準(zhǔn)中只有對(duì)丹參和虎杖的鑒別和膠囊劑項(xiàng)下規(guī)定的檢查項(xiàng)目，為了能更好地控制該制劑質(zhì)量，筆者采用HPLC法對(duì)制劑中丹參、白芍、虎杖等主藥成分所含丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷、大黃素進(jìn)行定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent HP1100高效液相色譜儀（安捷倫科技中國(guó)有限公司，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，四元泵）；萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利集團(tuán)，METTLER AG135）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2試藥 肝八味膠囊（規(guī)格為0.3 g／粒，上海方心制藥科技有限公司，批號(hào)20121201、20130601、20130602）。丹酚酸B對(duì)照品（111562-201212，含量95.4%）、芍藥苷對(duì)照品（110736-201337，含量94.9%）、虎杖苷對(duì)照品（111575-200301，含量100%）、大黃素（110756-200110，含量100%，），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純（德國(guó)默克），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件［2-5］色譜柱：A thena C18（250 mm ×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫，0～10 min，10%A；10～30 min，10%～30%A；30～35 min，30%～80%A；35～50 min，80%A；50～55 m in，80%～10%A；55～65 min，10%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm，流速：1.0 m l／min；進(jìn)樣量：10μl，按丹酚酸B計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于5 000。

2.2溶液的制備［2-5］①對(duì)照品溶液：分別稱取丹酚酸B對(duì)照品約10 mg、芍藥苷對(duì)照品約10 mg、虎杖苷對(duì)照品約5 mg，加甲醇定容到200 m l容量瓶制成混合對(duì)照品溶液；稱取大黃素對(duì)照品約10 mg稀釋到50 m l容量瓶中，再取稀釋液5 m l加入到上述混合對(duì)照溶液中，制成每1 m l含丹酚酸B 50μg、芍藥苷50μg、虎杖苷25μg、大黃素5μg的混合對(duì)照溶液。②供試品溶液：精密稱取供試品0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 m l，密塞，稱定重量，超聲處理30m in（功率250 W，頻率50 kHz），放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。③陰性對(duì)照溶液：按處方組成，制備不含丹參、白芍和虎杖的陰性模擬制劑，照上述供試品溶液的制備方法制備。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由色譜圖知，按丹酚酸B計(jì)算理論板數(shù)不低于5 000，丹酚酸B的保留時(shí)間約21.8min，芍藥苷的保留時(shí)間約22.9min，虎杖苷的保留時(shí)間約26.3 min，大黃素的保留時(shí)間約39.8 min，陰性對(duì)照溶液在上述位置均無(wú)干擾峰。丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷、大黃素與其他組分可做到完全基線分離。

圖1 HPLC色譜圖

2.4線性范圍的測(cè)定 樣品測(cè)定是以外標(biāo)法兩點(diǎn)法測(cè)定各成分的含量。

2.4.1 丹酚酸B 取丹酚酸B對(duì)照品配制成濃度為50.085μg／m l的溶液，分別進(jìn)樣3、5、10、15、20μl，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y＝10.194 49 X－7.249 89，r＝0.999 94，表明丹酚酸B在15.026～100.17μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 芍藥苷 取芍藥苷對(duì)照品配制成濃度為47.782 15μg／m l的溶液，分別進(jìn)樣3、5、10、15、20μl，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y＝7.128 98 X＋50.554 75，r＝0.999 96，表明芍藥苷在14.335～95.564μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 虎杖苷 取虎杖苷對(duì)照品配制成濃度為27.45μg／m l的溶液，分別進(jìn)樣3、5、10、15、20μl，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y＝9.099 58 X＋71.933 18，r＝0.999 89，表明虎杖苷在8.235～ 54.90μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 大黃素 取大黃素對(duì)照品配制成濃度為5.275μg／m l的溶液，分別進(jìn)樣3、5、10、15、20μl，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測(cè)定回歸方程：Y＝37.008 29 X＋58.108 71，r＝0.999 90，表明大黃素在1.582 5～10.55μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn) 分別精密吸?。ㄅ?hào)為20130602）同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μl，測(cè)定丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷和大黃素峰面積積分值，結(jié)果RSD丹酚酸B為0.15%（n＝6）；芍藥苷為0.10%（n＝6）；虎杖苷為0.18%（n＝6）；大黃素為0.12%（n＝6）。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸?。ㄅ?hào)為20130602）同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、24 h，精密吸取10μl注入液相色譜儀，測(cè)定丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷和大黃素各成分含量，結(jié)果RSD丹酚酸B為0.78%；芍藥苷為0.81%；虎杖苷為0.36%；大黃素為0.15%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)為20130602）供試品，平行制備6份供試液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，丹酚酸B RSD為1.35%（n＝6）；芍藥苷RSD為1.02%（n＝6）；虎杖苷RSD為1.15%（n＝6）；大黃素RSD為1.00%（n＝6），說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)20130602），精密加入混合對(duì)照品溶液（含丹酚酸B對(duì)照品50.085 mg／m l、芍藥苷對(duì)照品47.782 15 mg／m l、虎杖苷對(duì)照品27.45 mg／m l和大黃素對(duì)照品5.275 mg／m l）各10、15、20 m l，按供試品溶液制備方法操作，制成加樣供試品溶液。精密吸取上述加樣供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述方法測(cè)定加樣供試品溶液中丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷和大黃素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9樣品含量測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液和對(duì)照品溶液，精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，以外標(biāo)法兩點(diǎn)計(jì)算丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷和大黃素的含量，即得。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇［2］在一個(gè)系統(tǒng)中同時(shí)測(cè)定4種成分含量找到它們共同的最大吸收波長(zhǎng)尤為重要，根據(jù)查閱資料，4種成分吸收波長(zhǎng)均不同，丹酚酸B 269 nm，芍藥苷230 nm，虎杖苷306 nm，大黃素254 nm，分別在230、240、250、270 nm波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，最后發(fā)現(xiàn)在240 nm處各峰吸收均好，能完全分離，理論板數(shù)也最高，故確定240 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2供試品提取方法的確定［2］在供試品提取中，分別采取用50%甲醇和純甲醇超聲（10、20、30、60 min）、加熱回流提?。?0、60、120 m in）3種方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種成分在純甲醇中超聲30 min提取效果最好，測(cè)得含量最高，故選用純甲醇超聲30 min作為本實(shí)驗(yàn)供試品提取方法。

3.3流動(dòng)相比例確認(rèn) 通過(guò)查閱文獻(xiàn)［2-5］，發(fā)現(xiàn)測(cè)定這幾種成分用等度流動(dòng)相乙腈-水比較多，但比例都各不相同，后經(jīng)反復(fù)摸索采用梯度洗脫乙腈-水調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例能夠很好分離4種成分，雜峰干擾少，理論板數(shù)達(dá)到5 000以上。

3.4含量測(cè)定方法 每批樣品測(cè)得的丹酚酸B、芍藥苷、虎杖苷和大黃素含量各不相同，可能是每批樣品所用原藥材的含量不同所致，因此很有必要對(duì)這4種成分的含量做相應(yīng)的控制。本方為復(fù)方制劑，藥味多，成分復(fù)雜，經(jīng)多次試驗(yàn)，結(jié)果表明本方法的色譜條件柱效最高，分離度大，精密度高，重復(fù)性好，無(wú)干擾，且配制簡(jiǎn)單，能有效地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］ 上海市食品藥品監(jiān)督管理局.SYZ-ZF-014-2004上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)匯編［S］.2014-6-16.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22，70，96，194，569，592，958，1141.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)）中藥第七十冊(cè)［S］.北京：2008：4.

［4］ 國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)）中藥第七十一冊(cè)［S］.北京：2008：32.

［5］ 國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)）中藥第七十六冊(cè)［S］.北京：2009：64.

Simultaneous determ ination of four ingredients in Gan Bawei capsule by HPLCDAD

WU Lihong，CHU Zhongying，LIU Huijun（Shanghai Songjiang Institute for Food and Drug Control，Shanghai201600，China）

ObjectiveTo establish an HPLC-DAD method for simultaneous determ ination of four ingredients in Gan Baweicapsule.MethodsHPLCmethod was adopted w ith C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm），Acetonitrile asmobile phase A and water as mobile phase B in gradient elution mode.The detection wavelength was 240 nm and the flow rate was 1.0 m l／min.ResultsSalvianolic acid B reference substance was excellently linear in the range of 15.026～100.17μg／m l，the average recovery was 96.6%（n＝6）and RSD was 1.8%（n＝6）.Paeoniflorin reference substance was excellently linear in the range of 14.335～95.564μg／m l，the average recovery was 97.0%（n＝6）and RSD was 1.7%（n＝6）.Polydatin reference substance was excellently linear in the range of 8.235-54.90μg／m l，the average recovery was 97.2%（n＝6）and RSD was 1.8%（n＝6）.Emodin reference substance was excellently linear in the range of 1.582 5-10.55μg／m l，the average recovery was 98.1%（n＝6）and RSD was 1.7%（n＝6）.ConclusionThemethod was easy，accurate，reproducible，specific and w ithout interference in negative control，which could be used for quality control of Gan Bawei capsule.

Gan Baweicapsule；HPLC；salvianolic acid B；paeoniflorin；polydatin；emodin

R927.2

A

1006-0111（2015）03-0250-03

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.015

2014-02-18

2014-12-12

［本文編輯］ 顧文華

吳麗紅，本科，主管藥師.研究方向：醫(yī)院制劑質(zhì)量控制.Tel：（021）57822502，18917168208；E-mail：w ulihong＠smda.gov.cn