韓 燕，聞 俊，周婷婷，，范國榮（.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州35008；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海00433）

大孔吸附樹脂分離純化梔子豉湯有效部位的工藝研究

韓 燕1，聞 俊2，周婷婷1，2，范國榮2（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海200433）

目的研究大孔樹脂分離純化梔子豉湯有效成分的工藝條件及優(yōu)化。方法采用紫外分光光度法測定總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的量，以總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的含量作為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察上樣液濃度、上樣量、洗脫劑濃度及用量等對(duì)分離純化工藝的影響。結(jié)果最佳工藝條件：上樣液最佳吸附濃度為0.1 g／m l（該濃度以每1 m l中所含生藥材質(zhì)量計(jì)），上樣量與樹脂體積比是2∶1，吸附時(shí)間2 h，依次用1 BV（柱體積）水，6 BV 20%乙醇洗脫，6 BV 60%乙醇洗脫，收集洗脫液。結(jié)論該純化工藝合理、穩(wěn)定，可推廣于工業(yè)生產(chǎn)。

梔子豉湯；大孔吸附樹脂；分離純化；總環(huán)烯醚萜苷；總大豆異黃酮

梔子豉湯出自張仲景所著《傷寒論》，由梔子和淡豆豉兩味藥材組成，其主要的有效成分是梔子中的環(huán)烯醚萜苷類和淡豆豉中的的大豆異黃酮類。梔子豉湯在現(xiàn)代臨床上有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，組方精練，二藥配伍相得益彰，在現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料中看到其在臨床療效顯著，安全性高［1］。當(dāng)前對(duì)梔子豉湯的臨床應(yīng)用表明該方可用于調(diào)節(jié)血脂，治療抑郁焦慮、失眠、心煩，預(yù)防癌癥及肝炎等病癥，效果顯著［2-4］。目前對(duì)于梔子豉湯中兩類有效成分的分離研究都集中在單味藥上［5-7］，對(duì)復(fù)方僅在提取方法上有所研究［8］，對(duì)有效成分的分離鮮有研究報(bào)道。為了充分地分離和保留梔子豉湯中的有效成分，更好地發(fā)揮藥效，本實(shí)驗(yàn)利用大孔樹脂的吸附容量大、再生簡單、成本低廉、效果可靠、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，通過考察大孔吸附樹脂的分離純化條件，優(yōu)選最佳工藝條件，為梔子豉湯藥效物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究以及工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

UV2300紫外可見分光光度計(jì)（上海天美），梔子苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110749-200309）、染料木素對(duì)照品（深圳同田生物有限公司，批號(hào)：04090801），D101型大孔吸附樹脂（天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司），XS205DR電子天平（METTLER TOLEDO），紫外測定均采用30%甲醇水溶液作為溶劑，試劑均為分析純。

梔子和淡豆豉分別購于上海童涵春堂中藥飲片廠和浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室秦路平教授鑒定，分別為茜草科植物山梔（Gardenia jasm inoides Ellis）的干燥果實(shí)，大豆（Glycinmax）的種子炮制品?？偔h(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮粗提物由實(shí)驗(yàn)室人員從單味藥材中分離純化制得。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品3.02 mg置50 m l量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，搖勻，得60.4μg／m l的梔子苷對(duì)照品溶液；精密稱取染料木素對(duì)照品5.62 mg置50 m l量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，搖勻，得112.4μg／m l的染料木素對(duì)照品溶液。

2.2樣品溶液的制備 梔子和淡豆豉按2∶1的比例磨成粗粉，混勻，用50%的乙醇回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮（60℃）至無醇味，加水稀釋至2 g／m l（該濃度以每1 m l中所含總的生藥材質(zhì)量計(jì)）的上樣液，備用。

2.3最大吸收波長的確定 以30%甲醇分別配制一定濃度的梔子苷、染料木素對(duì)照品溶液和總環(huán)烯醚萜苷、總大豆異黃酮溶液，在紫外分光光度儀200～500 nm掃描，隨行空白對(duì)照。結(jié)果表明，對(duì)照品和樣品溶液分別在238 nm和260 nm處有最大吸收，且峰形相似，因此分別選238、260 nm作為總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的檢測波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取梔子苷和染料木素對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 m l于5 m l量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，搖勻。以30%甲醇為空白，在238 nm波長處測量梔子苷的吸光度，在260 nm波長處測量染料木素的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，分別繪制梔子苷和染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y＝0.023 8 X－0.003 5，r＝0.999 9，表明在6.04～30.20μg／m l范圍內(nèi)總環(huán)烯醚萜苷濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系；染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y＝0.013 4X＋0.004 5，r＝0.999 9，表明在11.24～56.20μg／m l范圍內(nèi)總大豆異黃酮濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5樹脂預(yù)處理 取D101型大孔吸附樹脂，經(jīng)分樣篩篩取20～80目的顆粒，用1 m l／L的鹽酸溶液浸泡4 h，然后用去離子水洗至中性，用1 m l／L的NaOH溶液浸泡4 h。然后用去離子水洗至中性，再用95%乙醇浸泡約24 h后用去離子水洗至無醇味，裝柱。

2.6D101型大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)選

2.6.1 上樣液濃度考察 取“2.2”項(xiàng)下樣品溶液適量，共7份，分別加水稀釋至濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 g／m l（該濃度以每1 m l中所含總的生藥材質(zhì)量計(jì)）。取D101型大孔吸附樹脂1.85 g，分別加入上述樣品液（相當(dāng)于1 g總的生藥材量），置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后測定樹脂靜態(tài)吸附率。吸附率按下式計(jì)算。

C0：樹脂吸附前溶液中總環(huán)烯醚萜苷或總大豆異黃酮的濃度；C1：樹脂吸附后溶液中總環(huán)烯醚萜苷或總大豆異黃酮的濃度；V：吸附液體積；M：樹脂干重。

分別以總固形物、總環(huán)烯醚萜苷以及大豆異黃酮樹脂吸附率對(duì)生藥材濃度作圖，見圖1。樹脂對(duì)樣品的吸附一般在低濃度情況下有利，但樣品液濃度太低則上樣液體積太大，操作煩瑣。故結(jié)合圖中生藥材濃度對(duì)樹脂吸附率的影響趨勢，本工藝中生藥材的最佳吸附濃度為0.1 g／m l。

圖1 不同濃度下D101型大孔吸附樹脂的吸附率

2.6.2 樹脂靜態(tài)吸附平衡曲線的測定 稱取預(yù)處理好的大孔吸附樹脂適量，加入0.1 g／m l的樣品液20 m l，置于恒溫?fù)u床中振搖，于不同時(shí)間（0.5、1、2、4、6、8、10 h）取樣并測定樹脂對(duì)總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的吸附量Q。以Q對(duì)時(shí)間t制圖，得到樹脂對(duì)總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的靜態(tài)吸附平衡曲線，見圖2。結(jié)果表明樣品靜態(tài)吸附2 h即可達(dá)到吸附平衡。

圖2 D101型大孔吸附樹脂對(duì)梔子豉湯中有效成分的靜態(tài)吸附平衡曲線

2.6.3 洗脫溶劑解吸考察 在充分吸附樣品后的大孔樹脂中分別精密加入一定體積不同濃度乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）進(jìn)行樹脂解吸試驗(yàn)，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h，測定解吸液中總環(huán)烯醚萜苷和大豆異黃酮的含量，計(jì)算解吸率（圖3）。由圖3可知，20%的乙醇就可以把環(huán)烯醚萜苷基本洗脫出來，60%的乙醇可以洗脫出大部分的大豆異黃酮。

圖3 不同濃度乙醇洗脫液對(duì)梔子豉湯中有效成分的解吸率

2.6.4 泄露曲線 將0.1 g／m l的樣品液緩慢地加到已預(yù)處理好的裝有40 m l樹脂的層析柱中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附?？刂屏魉贋? BV／h，按份收集流出液，每10 m l收集一份，測定流出液中總環(huán)烯醚萜苷和大豆異黃酮的含量，當(dāng)樹脂不再吸附總環(huán)烯醚萜苷和大豆異黃酮時(shí)，停止上樣，以流出液中總環(huán)烯醚萜苷和大豆異黃酮的濃度對(duì)所加樣品液體積制圖，繪制泄露曲線（圖4）。由圖4可知，當(dāng)上樣體積為80 m l時(shí)，總環(huán)烯醚萜苷開始明顯泄露，總大豆異黃酮也開始泄露，故確定最佳上樣量與樹脂體積比為2∶1。

圖4 梔子豉湯中有效成分大孔樹脂純化工藝泄露曲線

2.6.5 洗脫溶劑用量考察 取活化好的D101樹脂裝柱，上樣量為藥材（m l）／樹脂（m l）（2∶1），樣品液濃度為0.1 g／m l，上樣后靜態(tài)吸附2 h，先以1 BV的水洗脫，再用20%乙醇解吸，分段收集洗脫液（以樹脂床體積計(jì)），最后用60%乙醇解吸，分段收集洗脫液，測定洗脫液中總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的濃度，以總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的濃度對(duì)體積制圖，繪制洗脫曲線（圖5）。由圖5可知，前1 BV為水洗脫，在此期間環(huán)烯醚萜苷有效成分基本沒有流失；從第2 BV開始為20%乙醇洗脫，洗脫6 BV后環(huán)烯醚萜苷基本被洗脫，同時(shí)大豆異黃酮也開始被洗脫出來，此時(shí)用60%的乙醇洗脫6 BV后大豆異黃酮基本被洗脫，由此可見本工藝可以很好地分離純化梔子豉湯中的兩類有效成分。

圖5 梔子豉湯中有效成分洗脫曲線

2.7驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述優(yōu)選工藝制備3批樣品液，測定總環(huán)烯醚萜苷和總大豆異黃酮的含量。結(jié)果見表1。表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表1 梔子豉湯純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)3批樣品的結(jié)果（n＝3）

3 討論

藥材粗提物的水溶液中還有很多不溶性的雜質(zhì)，如果直接上大孔樹脂會(huì)堵塞大孔樹脂，影響分離純化效果，因此在上樣前應(yīng)對(duì)樣品液進(jìn)行一定的前處理。洗脫溶劑為乙醇溶液，成本低廉且綠色環(huán)保，不污染環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格控制水和乙醇的用量，先用少量的水洗脫，既可以洗掉大量的水溶性成分，又能避免環(huán)烯醚萜苷中極性大的成分被洗脫出來，控制20%乙醇的用量，在環(huán)烯醚萜苷類成分基本洗脫出來的同時(shí)減少大豆異黃酮成分的流失。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳純化工藝是上樣液吸附濃度為0.1 g／m l（該濃度以每1 m l中所含生藥材質(zhì)量計(jì)），上樣量與樹脂體積比是2∶1，吸附時(shí)間2 h，依次用1 BV水，6 BV 20%乙醇洗脫，6 BV 60%乙醇洗脫。按照此工藝分離純化梔子豉湯中的有效成分，總環(huán)烯醚萜苷的平均得率和純度分別為7.9%、72.7%；總大豆異黃酮的平均得率和純度分別為6.0%、58.3%。本實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)化工藝使梔子豉湯中的兩類有效成分得到了很好的分離，得率和純度也很高，且成本低，綠色環(huán)保無污染，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，并為梔子豉湯進(jìn)一步開發(fā)和研究奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

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The research of separation and purification technology for effective parts from Zhizichi decoction by macroporous absorption resina

HAN Yan1，WEN Jun2，ZHOU Tingting1，2，F(xiàn)AN Guorong2（1.College of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China；2.School of Pharmacy，The Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo optim ize separation and purification technology of Zhizichi decoction by macroporous resina.MethodsThe content of total iridoid glycosides and total isoflavones were determined by ultraviolet spectrophotometry.Taking the content of total iridoid glycosides and total isoflavones as indexes，the effect of the concentration of sample solution，medicinal herbs on the amount of sample，concentration and volume of eluentwas investigated by single factor test.ResultsThe optimum separation and purification technology was as follow ing：the concentration of sample solution was 0.1 g／m l，the volume ratio of resin tomaterial drug was 2∶1，the adsorption timewas 2 h，and the samplewas firstly eluted with 1 BV water，then 6 BV 20%ethanoland 60%ethanol，and theeluentwas collected.ConclusionThis optimized separation and purification technology was reasonable and stable，and it could be extended to large-scale production applications.

Zhizichidecoction；macroporous absorption resin；separation and purification；total iridoid glycosides；total isoflavones

R943

A

1006-0111（2015）03-0238-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.012

2014-12-18

2015-01-28

［本文編輯］ 陳靜

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30801541）

韓 燕，碩士研究生.研究方向：中藥化合物組及代謝物組的多維色譜-質(zhì)譜等新技術(shù)研究.E-mail：han123yan.ok＠163.com

周婷婷，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師.研究方向：中藥化合物組及代謝物組的多維色譜-質(zhì)譜等新技術(shù)研究.Tel：（021）81871261-82；E-mail：tingting_zoo＠163.com