沈頤涵

（上海信誼藥廠有限公司制藥總廠，上海201206）

0 引言

雙歧桿菌是人體消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢菌群，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的雙歧桿菌有32種，其中分離自人體的有12種。雙歧桿菌作為人體消化道中的原生菌以及其微生態(tài)制品所具有的特有性質(zhì)，使其備受學(xué)術(shù)界和商界的關(guān)注[1]。

目前，可用于保健食品的雙歧桿菌主要有5種：兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長型雙歧桿菌、短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌[2]。已見報(bào)道的雙歧桿菌的生理功能包括：調(diào)整腸道菌群[3-4]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[5]、防止便秘、降低結(jié)腸癌的發(fā)病率[6]、產(chǎn)生抗菌素[7]、提高蛋白質(zhì)和維生素的代謝、緩解乳糖不耐癥、治療肝損傷、抗腫瘤、降低膽固醇[8]等。

雙歧桿菌類產(chǎn)品主要有食品、保健品和藥品等，而在此類產(chǎn)品的開發(fā)中，由于雙歧桿菌對生存環(huán)境的要求較為苛刻，使其高密度培養(yǎng)成為限制工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。因此，如何縮短培養(yǎng)時間并提高發(fā)酵液活菌數(shù)就成為了技術(shù)關(guān)鍵。在我廠目前的工藝條件下，嬰兒雙歧桿菌的發(fā)酵液活菌數(shù)為8.0×109cfu/g左右。

本研究通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)控制參數(shù)，旨在提高發(fā)酵液活菌量，為今后嬰兒雙歧桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種：嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）由上海信誼藥廠有限公司藥物研究所微生態(tài)制品研究室保藏。

培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、乳糖10 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵0.05 g/L、L-半胱氨酸0.25 g/L。

1.2 儀器設(shè)備

5 L發(fā)酵罐及配套系統(tǒng)（上海國強(qiáng)生化工程裝備）；GQ75B高速管式離心機(jī)（上海浦東天本離心機(jī)械）；培養(yǎng)箱（Binder）；PHS-3E型精密pH計(jì)（上海雷磁）；Cary50紫外分光光度計(jì)（Varian）；BP3100S電子分析天平（Sartorius）；滅菌鍋（Tony）；厭氧產(chǎn)氣袋（梅里埃）。

1.3 試驗(yàn)方法

采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵研究，裝罐量為3 L，分別研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH值、攪拌轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵時間對發(fā)酵液中活菌數(shù)量的影響，活菌量以lg活菌數(shù)值表示。

1.3.1 發(fā)酵液活菌數(shù)的測定

采用血瓊脂平板計(jì)數(shù)法，梯度稀釋至約菌數(shù)20～160個/mL后涂平板，置于（37±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

嬰兒雙歧桿菌按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH值為6.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，分別置于32℃、35℃、37℃、39℃、42℃溫度下發(fā)酵10 h，發(fā)酵結(jié)束后放罐，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.3.3 發(fā)酵pH值對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

按照1.3.2所確定的最適合發(fā)酵溫度，將嬰兒雙歧桿菌接種于pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下發(fā)酵10 h，發(fā)酵結(jié)束后放罐，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.3.4 攪拌速度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

按照1.3.2和1.3.3所確定的最適合發(fā)酵溫度和pH值，將嬰兒雙歧桿菌分別在200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的攪拌速度下發(fā)酵10 h，發(fā)酵結(jié)束后放罐，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.3.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

按照1.3.2、1.3.3和1.3.4所確定的最佳發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵嬰兒雙歧桿菌，每2 h取發(fā)酵液，分別測定其活菌數(shù)，繪制嬰兒雙歧桿菌的生長曲線，確定該菌的最佳發(fā)酵時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵控制參數(shù)的選擇

2.1.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

發(fā)酵過程中，溫度對微生物的生長有著較為重要的影響。一般提高溫度，能夠加速細(xì)胞分裂，使微生物的生長速度加快，但過高的溫度會對微生物的生長起到抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在pH值6.0、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度分別為32℃、35℃、37℃、39℃、42℃的條件下厭氧發(fā)酵10 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵液的活菌數(shù)

圖1 可以看出：發(fā)酵溫度對雙歧桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響較為明顯，且在不同的溫度條件下，發(fā)酵液的菌落數(shù)存在差異。溫度升高超過37℃后，嬰兒雙歧桿菌的生長速度并未有明顯的提高。該菌株在37℃的條件發(fā)酵液中l(wèi)g活菌數(shù)達(dá)到最高值9.38，折算成活菌數(shù)2.4×109cfu/mL，表明溫度37℃為嬰兒雙歧桿菌的最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.1.2 pH值對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

在微生物發(fā)酵過程中，除了選擇合適的溫度外，維持發(fā)酵體系pH值的穩(wěn)定也至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中，嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的條件下發(fā)酵10 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下發(fā)酵液的活菌數(shù)

圖2 可以看出：發(fā)酵培養(yǎng)的pH值對嬰兒雙歧桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響明顯，在pH6.5的條件下，發(fā)酵液菌體濃度最高，lg活菌數(shù)為9.77，折算發(fā)酵液活菌數(shù)約為5.84×109cfu/mL，表明pH值為6.5為嬰兒雙歧桿菌的最適發(fā)酵培養(yǎng)pH值。

2.1.3攪拌速度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、pH值為6.5、攪拌轉(zhuǎn)速分別為200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的條件下發(fā)酵10 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同攪拌速度條件下發(fā)酵液的活菌數(shù)

圖3 可以看出：發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速對嬰兒雙歧桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響明顯。攪拌轉(zhuǎn)速提升，發(fā)酵液活菌數(shù)反而隨之下降，這可能是因?yàn)閶雰弘p歧桿菌是厭氧菌，在發(fā)酵過程中需要厭氧環(huán)境。攪拌轉(zhuǎn)速的增加，一定程度上增加了發(fā)酵體系中的溶解氧，使該菌株的生長環(huán)境發(fā)生變化所致。本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下發(fā)酵液的lg活菌數(shù)最高達(dá)到9.93，折算活菌數(shù)為8.33×109cfu/mL，表明嬰兒雙歧桿菌的最適攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、pH值6.5、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下，試驗(yàn)不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液lg活菌數(shù)值，發(fā)酵液的活菌數(shù)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵液的活菌數(shù)

圖4 可以看出：在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)酵液的lg活菌數(shù)值在發(fā)酵前期隨時間的延長而增長，在培養(yǎng)10～12 h后達(dá)到最高值，隨后lg活菌數(shù)值增長緩慢?？紤]到發(fā)酵液的lg活菌數(shù)在10 h之后變化不大，因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)的時間為10 h較好。發(fā)酵10 h的結(jié)果顯示，發(fā)酵液中活菌數(shù)可達(dá)約4.5×1010cfu/mL。

2.2 發(fā)酵控制參數(shù)的優(yōu)化

為了確定其發(fā)酵培養(yǎng)的最佳控制參數(shù)，以發(fā)酵液的活菌數(shù)作為檢測指標(biāo)，通過單因素篩選獲得的發(fā)酵控制參數(shù)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)如表1所示，以期最大限度提高嬰兒雙歧桿菌的發(fā)酵液活菌量。

表1 發(fā)酵控制參數(shù)設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)表

通過正交試驗(yàn)，分析試驗(yàn)結(jié)果（表2），綜合考察最終選擇最佳發(fā)酵控制參數(shù)方案為C1D2A2B2，即溫度37℃、pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時間10 h。

表2 試驗(yàn)結(jié)果分析

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化控制參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際測得在優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)條件下，嬰兒雙歧桿菌的發(fā)酵液活菌量可達(dá)4.5×1010cfu/mL，表明正交試驗(yàn)所得出的最佳發(fā)酵控制參數(shù)可行。

3 結(jié)語

經(jīng)過對嬰兒雙歧桿菌的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵pH值、攪拌轉(zhuǎn)速以及培養(yǎng)時間的研究，優(yōu)化篩選出了其最佳的發(fā)酵控制參數(shù)。與現(xiàn)有工藝相比，發(fā)酵菌體的得率能夠提升約5.6倍。

本研究通過對嬰兒雙歧桿菌發(fā)酵特性的研究，有效提高了發(fā)酵液活菌濃度，為今后嬰兒雙歧桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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