胡燕梅，夏景波，方中明，郭云貴，楊永會(huì)

（1.江漢大學(xué)　期刊社，湖北　武漢　430056；2.暨南大學(xué)　生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東　廣州　510632；3.武漢生物工程學(xué)院　生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北　武漢　430415）

大花蕙蘭快速繁殖體系的初步建立

胡燕梅1，夏景波2，方中明*3，郭云貴3，楊永會(huì)3

（1.江漢大學(xué)期刊社，湖北武漢430056；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510632；3.武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430415）

摘要：探討了4種大花蕙蘭外植體誘導(dǎo)原球莖形成的效果和不同激素配比對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)及增殖與分化培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：誘導(dǎo)原球莖適宜外植體為莖尖，培養(yǎng)60 d后誘導(dǎo)率達(dá)到76.0％。而其他3種外植體均不能有效誘導(dǎo)原球莖形成；其中0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA激素組合誘導(dǎo)莖尖原球莖形成率達(dá)到87.8％；而莖尖原球莖在各激素組合處理中增殖率均能達(dá)到100％。原球莖在1.5 mg/L KT +0.5 mg/L IBA激素組合中增殖與分化效果最好，增殖系數(shù)和分化系數(shù)分別達(dá)到5.19和2.80。

關(guān)鍵詞：大花蕙蘭；快速繁殖；莖尖；原球莖；增殖與分化

大花蕙蘭為蘭科蘭屬植物，是蘭屬中的大花附生種、小花垂生種以及一些地生蘭經(jīng)過100多年的多代人工雜交育成的品種群［1］。其葉長(zhǎng)碧綠，花姿粗獷，豪放壯麗，是世界著名的“蘭花新星”。它具有國(guó)蘭的幽香典雅，又有洋蘭的豐富多彩，在國(guó)際花卉市場(chǎng)十分暢銷，深受花卉愛好者的喜愛［2］。為加快其繁殖速度、縮短繁殖周期，大花蕙蘭的育苗常常采用植物組織培養(yǎng)方式［3-4］。根據(jù)已有的研究報(bào)道，大花蕙蘭組織培養(yǎng)一般采用原球莖途徑［5-8］，即原球莖的成功誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)是大花蕙蘭利用植物組織培養(yǎng)方式實(shí)現(xiàn)快速繁殖的首要步驟。植物激素是組織培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵性物質(zhì)，各激素在培養(yǎng)基中相互協(xié)調(diào)、相互影響，協(xié)同促進(jìn)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)與發(fā)育。外源激素中常用的有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。本試驗(yàn)探討了4種不同外植體誘導(dǎo)原球莖產(chǎn)生的效果和不同激素組合對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)和增殖分化的影響，為利用植物組織培養(yǎng)方式實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭種苗快速繁殖打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源和培養(yǎng)條件

大花蕙蘭組培苗購(gòu)于云南高科農(nóng)業(yè)有限公司。將無(wú)菌組培苗取出，選取不同外植體接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，探討其原球莖誘導(dǎo)效果。后期又將成功誘導(dǎo)的原球莖通過無(wú)菌操作接種于增殖和分化培養(yǎng)基中。培養(yǎng)方式為固體培養(yǎng)，于（25±2）℃光照培養(yǎng)箱中，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體對(duì)大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)的影響4種外植體分別取自大花蕙蘭幼葉、莖尖、根尖及根兜。在無(wú)菌條件下，將大花蕙蘭無(wú)菌組培苗置于超凈工作臺(tái)上，剝?nèi)ソM培苗外面數(shù)層葉片。取最里層幼葉，用解剖刀切成約1 cm2的小塊作為外植體用于接種；將里層幼葉剝離后取2～3 mm莖尖作為外植體用于接種；將嫩根根尖切成0.3～0.6 cm小段作為外植體用于接種；切取根基部0.1～0.2 cm根兜作為外植體用于接種；將不同外植體分別接種于MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA +30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+2 g/L活性炭+100 g/L香蕉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d和60 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

香蕉汁制法：100 g去皮的新鮮香蕉，剪成小塊，放于約500 mL蒸餾水中加熱攪拌成糊狀，4層紗布多次過濾，收集濾液用于培養(yǎng)基的配置。

1.2.26-BA與NAA組合對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)的影響以莖尖為外植體，以MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+ 2 g/L活性炭+100 g/L香蕉汁為基本培養(yǎng)基，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA和0.1、0.2 mg/L NAA組合的8種不同配比的激素，以檢測(cè)6-BA和NAA組合對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)的影響。

1.2.3植物激素對(duì)大花蕙蘭原球莖培養(yǎng)的影響試驗(yàn)以莖尖誘導(dǎo)的原球莖為接種材料，以MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+2 g/L活性炭+100 g/L香蕉汁為基本培養(yǎng)基，KT+NAA和KT+IBA兩組激素做供試因子，KT濃度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA和IBA濃度均設(shè)置為0.1 mg/L和0.5 mg/L。分別研究?jī)山M激素組合對(duì)大花蕙蘭原球莖增殖與分化培養(yǎng)的影響。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

外植體接種培養(yǎng)30 d和60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖誘導(dǎo)率；原球莖接種培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)其增殖率、增殖系數(shù)和分化系數(shù)。

有效接種數(shù)：經(jīng)培養(yǎng)后未污染的接種數(shù)。

原球莖誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出原球莖的有效接種數(shù)/有效接種數(shù)）×100％。

原球莖增殖率=（原球莖增殖的有效接種數(shù)/有效接種數(shù)）×100％。

原球莖增殖系數(shù)是以每個(gè)原球莖經(jīng)培養(yǎng)60 d后所形成的原球莖總個(gè)數(shù)的平均值（以3 mm左右的原球莖小塊為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。

分化系數(shù)是以每個(gè)原球莖經(jīng)培養(yǎng)60 d后分化出的試管苗總數(shù)的平均值。

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS 17.0軟件中完全隨機(jī)單因素試驗(yàn)方差分析鄧肯氏新復(fù)極差法評(píng)估各試驗(yàn)處理間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

4種外植體接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)后效果差異較大（見圖1）。莖尖培養(yǎng)初期膨大成乳白色球狀物，繼續(xù)培養(yǎng)后期形成典型的原球莖，且顏色逐漸加深，由乳白色變?yōu)辄S綠色，最后成綠色。莖尖形成的原球莖雖個(gè)體生長(zhǎng)緩慢，但綠色加深，后期在原球莖頂部出現(xiàn)芽尖并分化成苗。根尖培養(yǎng)7 d后開始膨大并伸長(zhǎng)，表面粗糙并長(zhǎng)出乳白色的小突點(diǎn)，14 d后體積增大2～4倍。但繼續(xù)培養(yǎng)根尖頂端只是不斷伸長(zhǎng)，60 d后再無(wú)明顯變化，沒有成功誘導(dǎo)出原球莖。幼葉培養(yǎng)20 d后葉片明顯長(zhǎng)大，但無(wú)卷曲、變厚的生長(zhǎng)跡象，培養(yǎng)40 d后葉片停止生長(zhǎng)，約50 d后葉片發(fā)黃而枯死。根兜培養(yǎng)初期體積膨大，但后期繼續(xù)培養(yǎng)所有根兜均發(fā)黃而枯死，無(wú)生長(zhǎng)跡象。

4種外植體培養(yǎng)30 d和60 d后誘導(dǎo)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。大花蕙蘭4種不同外植體在同一培養(yǎng)基上培養(yǎng)后原球莖誘導(dǎo)差異明顯，僅莖尖部位成功誘導(dǎo)出原球莖，30 d時(shí)原球莖誘導(dǎo)率達(dá)到72.0％，60 d后原球莖誘導(dǎo)率達(dá)到了76.0％，表明隨著時(shí)間延長(zhǎng)莖尖誘導(dǎo)率仍緩慢增加。而另外3種外植體幼葉、根尖和根兜誘導(dǎo)率均為0，沒有成功誘導(dǎo)出原球莖。

圖1　4種外植體培養(yǎng)60 d后的效果Fig.1 Culture effects of four kinds of explants after 60 d

表1　4種外植體誘導(dǎo)原球莖的效果Tab.1 Inducing effects of protocorm with four kinds of explants

2.26-BA與NAA組合對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)效果的影響

將莖尖接種于不同配比的6-BA和NAA激素組合的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d和60 d后其原球莖誘導(dǎo)效果見表2。從表2可以看出原球莖誘導(dǎo)率培養(yǎng)60 d普遍較培養(yǎng)30 d高，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)原球莖誘導(dǎo)率增加。0.1 mg/L NAA處理組培養(yǎng)60 d后平均誘導(dǎo)率達(dá)到72.4％，0.2 mg/L NAA處理組僅達(dá)到63.9％，即低濃度NAA更利于莖尖原球莖的誘導(dǎo)。而在0.1 mg/L NAA同一處理組中，6-BA濃度越高原球莖誘導(dǎo)率越低，誘導(dǎo)效果越差。其中0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA較適合于原球莖誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了87.8％。

表2　BA與NAA組合對(duì)莖尖原球莖誘導(dǎo)的影響Tab.2 Influence of BA and NAA treatment to protocorm induced by stem tip

2.3植物激素對(duì)大花蕙蘭原球莖增殖和分化的影響

將莖尖誘導(dǎo)的原球莖經(jīng)過適當(dāng)切割后，接種于KT+NAA和KT+IBA兩組激素處理組的培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，發(fā)現(xiàn)原球莖均不同程度的生長(zhǎng)變大，有增殖現(xiàn)象，且增殖率均達(dá)到了100％。原球莖在增殖生長(zhǎng)的后期均分化出芽尖，后期芽尖長(zhǎng)成小試管苗，長(zhǎng)勢(shì)明顯（見圖2）。

圖2　培養(yǎng)60 d后的原球莖及其上分化出的小試管苗Fig.2 After 60 d culture of protocorm

不同處理組的原球莖增殖和分化效果差異明顯，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)60 d后原球莖的增殖系數(shù)與分化系數(shù)，結(jié)果見表3。從表3中可以看出1.5 mg/L KT＋0.5 mg/L IBA處理組的大花蕙蘭原球莖增殖系數(shù)和分化系數(shù)均達(dá)到顯著性最高，即5.19和2.80。將表3中KT+NAA和KT+IBA處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行平均處理，結(jié)果見表4。由表4可知，高濃度0.5 mg/L的生長(zhǎng)素NAA和IBA促進(jìn)原球莖增殖和分化的效果要顯著好于0.1 mg/L處理組，即生長(zhǎng)素濃度對(duì)原球莖增殖與分化有主要影響。而在濃度相同的情況下，NAA處理略強(qiáng)于IBA處理，但兩種生長(zhǎng)素處理的原球莖增殖系數(shù)與分化系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明同濃度的NAA和IBA即生長(zhǎng)素種類對(duì)原球莖增殖與分化無(wú)顯著性影響。

表3　植物激素對(duì)大花蕙蘭原球莖培養(yǎng)的影響Tab.3 Influence of plant hormone to cymbidium protocorm culture

表4　植物激素對(duì)大花蕙蘭原球莖培養(yǎng)的數(shù)據(jù)平均處理后的結(jié)果Tab.4 Data results of influence of plant hormone treatment

試驗(yàn)結(jié)果表明：激素組合為KT+IBA時(shí)利于原球莖增殖與分化，其中1.5 mg/L KT +0.5 mg/L IBA處理組原球莖增殖與分化效果最好。

3　討論

利用4種大花蕙蘭外植體對(duì)其誘導(dǎo)原球莖做了初步研究。結(jié)果表明：誘導(dǎo)原球莖適宜外植體為莖尖，其中0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA為莖尖誘導(dǎo)原球莖較適激素組合，培養(yǎng)60 d后原球莖誘導(dǎo)率達(dá)到87.8％；而幼葉、根尖和根兜效果均不如莖尖效果明顯。目前，已報(bào)道大花惠蘭組織培養(yǎng)使用的外植體有莖尖［9-11］、莖段［12］、花梗［12］、葉片［12］、花瓣［12］、幼根［13］等，但除莖尖外，其他外植體培養(yǎng)成功率很低。本試驗(yàn)采用的4種外植體誘導(dǎo)原球莖，結(jié)果也表明采用莖尖作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)容易成功，獲得的原球莖性狀均一，繁殖速度快。但莖尖作為外植體采集時(shí)容易損傷大花蕙蘭母株，而且取材難度相對(duì)較大，增加了組織培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。國(guó)內(nèi)對(duì)于大花蕙蘭根尖進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)的研究很少，趙穎等［13］報(bào)道的根尖誘導(dǎo)效果較好，而本試驗(yàn)中根尖初次培養(yǎng)并沒有成功誘導(dǎo)出原球莖，可能與試驗(yàn)所用大花蕙蘭品種差異有關(guān)。在根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)的后續(xù)試驗(yàn)中將根尖頂部新長(zhǎng)出的根尖切下，接入含MS+1.5 mg/L 6- BA +0.1 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+2 g/L活性炭+100 g/L香蕉汁培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，根尖又繼續(xù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。這樣將新長(zhǎng)出的根尖重復(fù)接種培養(yǎng)兩次后觀察到根尖能誘導(dǎo)少量原球莖，培養(yǎng)2個(gè)月后誘導(dǎo)率達(dá)到了9.45％，但原球莖誘導(dǎo)率仍然遠(yuǎn)低于莖尖，表明根尖作為誘導(dǎo)原球莖形成的外植體部位有待進(jìn)一步研究。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用是植物組織培養(yǎng)過程中的重要影響因子，也對(duì)原球莖的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)起重要作用。谷祝平等［10］報(bào)道較低濃度6-BA促進(jìn)原球莖的誘導(dǎo)，較高濃度的6-BA能促進(jìn)大花蕙蘭原球莖增殖。本試驗(yàn)在莖尖原球莖誘導(dǎo)階段，結(jié)果也顯示較低濃度即0.5 mg/L 6-BA誘導(dǎo)原球莖的效果最好，且誘導(dǎo)時(shí)間短、原球莖大。

在本試驗(yàn)中還探索了KT+IBA和KT+NAA激素組合對(duì)大花蕙蘭原球莖增殖和分化效果的影響，其中1.5mg/L KT+0.5mg/L IBA效果最好。而龔漢雨等［14］報(bào)道植物生長(zhǎng)素2，4-D也能夠顯著影響大花蕙蘭原球莖的增殖，還有研究者嘗試使用細(xì)胞分裂素TDZ，也獲得了良好的效果［15-16］。因此，在今后的研究中，綜合考慮多種激素組合、適宜的激素濃度及低成本的激素種類，以獲得原球莖培養(yǎng)的適宜激素配方的培養(yǎng)基，是實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭組織培養(yǎng)的前期保證。

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（責(zé)任編輯：陳曠）

Preliminary Establishment of Rapid Propagation System of Cymbidium Hybridum

HU Yanmei1，XIA Jinbo2，F(xiàn)ANG Zhongming*3，GUO Yungui3，YANG Yonghui3
（1.Periodicals Press，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China；2.School of Life Science and Technology，Jinan University，Guanghzou 510632，Guangdong，China；3.Life Science and Technology College，Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，Hubei，China）

Abstract：The formation effects of protocorm of cymbidium induced by four kinds of explants are dis?cussed，as well as the influence of hormone proportion to proliferation and differentiation of protocorm in?duction.The experiment results showed the best explants for protocorm induction were stem tips，the in?ducing rate reached 76.0％ after 60 days culture.The three other explants could not effectively induce the protocorm.With 0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA treatment，the formation rate of protocorm induced by stem tip reached 87.8％，and the proliferation rate of protocorm induced by stem tip with each hormone treatment all reached 100％，the proliferation and differentiation of protocorm were the best with the treat?ment of 1.5 mg/L KT + 0.5 mg/L IBA，the proliferation coefficient and the differentiation coefficient are 5.19 and 2.80，respectively.

Keywords：cymbidium；rapid propagation；stem tip；protocorm；proliferation and differentiation

*通訊作者：方中明（1984—），男，講師，博士，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail：zmfang@mail.hzau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：胡燕梅（1979—），女，副教授，碩士，研究方向：植物學(xué)及植物生物技術(shù)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31301250）；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（B20094008）；武漢市高?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（2008K079）

收稿日期：2015 - 03 - 03

DOI：10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.03.010

中圖分類號(hào)：S682.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-0143（2015）03-0248-05