覃彩霞，張俊亞，佟娟,*，申佩弘，魏源送,3

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室，北京 10085 2. 廣西大學生命科學與技術學院，南寧 530005 3. 江西省科學院能源研究所，南昌 330096

MBR工藝處理螺旋霉素制藥廢水過程中抗生素耐藥菌與抗性基因的研究

覃彩霞1,2，張俊亞1，佟娟1,*，申佩弘2，魏源送1,3

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室，北京 10085 2. 廣西大學生命科學與技術學院，南寧 530005 3. 江西省科學院能源研究所，南昌 330096

抗生素廢水含有大量的抗生素耐藥菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)與抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)，處理排放后可能增強受納環(huán)境的微生物抗性，因此有必要深入研究抗生素廢水處理過程中ARB與ARGs的削減效果及其影響因素。本研究采用膜生物反應器(membrane bioreactor, MBR)工藝處理螺旋霉素制藥廢水，考察了不同水力停留時間(hydraulic retention time, HRT)對ARB與ARGs削減效果的影響。結果表明，雖然在HRT=30 h時MBR對COD與氨氮的去除率略高于HRT=40 h，但HRT=40 h時，不僅總異養(yǎng)菌與腸球菌的去除效果更佳，出水腸球菌耐藥率及攜帶的抗性基因檢出率也更低，而且MBR對廢水中ermB、ermF、ermX、mefA、ereA、mphB和轉移元件ISCR1、Tn916/1545相對豐度的削減效果更好。這表明長HRT更有利于MBR工藝削減螺旋霉素廢水的耐藥菌與抗性基因。

耐藥菌；抗性基因；螺旋霉素制藥廢水；膜生物反應器；水力停留時間

抗生素耐藥菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)與抗性基因(antibiotic resistance gene, ARGs)已成為全球關注的熱點，目前已經在廢水、地表水、地下水、沉積物、土壤等環(huán)境中檢測到ARB與ARGs的存在[1-3]，這對環(huán)境和人體健康構成了巨大的潛在危害。我國是世界上最大的抗生素生產與消費國，然而抗生素制藥廢水不僅有機物濃度高，難于處理，對環(huán)境造成了嚴重的危害[4]，并且抗生素廢水中含有高濃度的抗生素殘余物[5-6]，在處理過程中可能會產生大量抗生素耐藥菌，導致高濃度抗生素和抗生素耐藥菌隨著出水排放不斷進入環(huán)境。近年來，醫(yī)藥廢水分離出來的大腸桿菌中超過75%為高耐藥水平的超廣譜耐藥菌，豐度甚高，嚴重威脅人類的健康[7]，且醫(yī)藥廢水中細菌的耐藥率也明顯高于相鄰水體中的細菌[8-9]。因此，抗生素制藥廢水造成的抗性污染不容忽視。

膜生物反應器工藝(membrane bioreactor, MBR)是膜技術與污水生物處理技術有機結合的一種新型、高效的廢水處理工藝，廣泛應用于污水處理與回用。Munir等[10]調研了美國5個利用不同處理工藝的城市污水處理廠對抗生素耐藥菌與抗性基因的去除情況，研究結果發(fā)現(xiàn)MBR工藝具有顯著的ARB與ARGs去除效果(2.57～7.06 logs)，優(yōu)于傳統(tǒng)活性污泥工藝(2.37～4.56 logs)。但是MBR運行過程中，不同工藝操作參數(shù)對其中ARB與ARGs去除效果的影響鮮見相關報道，水力停留時間(HRT)作為MBR運行過程中最重要的參數(shù)之一，值得進行深入探討。

因此，本文以江蘇無錫某螺旋霉素制藥廢水為研究對象，重點考察和比較不同水力停留時間對MBR工藝去除抗生素耐藥菌和抗性基因的影響，并初步探討了其影響機制。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 樣品采集

江蘇省無錫市某螺旋霉素制藥廠廢水處理站廢水處理流程為：調節(jié)池-厭氧池-缺氧池-好氧池-二沉池。本研究采集該廠缺氧池出水作為實驗室MBR裝置的進水。在HRT=40 h時，每半個月取樣1次，取樣點為MBR進水、MBR活性污泥、MBR出水，共取樣4次；然后將MBR裝置的HRT調整為30 h，在相同取樣點每半個月取樣1次，共取樣3次。

1.2 MBR裝置及其操作參數(shù)

實驗室規(guī)模一體式MBR污水處理裝置采用SINAP-10-PVDF平板膜組件(上海斯納普公司)，有效膜面積為0.1 m2；膜組件外形尺寸：寬×高×厚=220 mm ×320 mm×6 mm；膜孔徑為0.1 μm；運行膜通量為8 L·(m2·h)-1。生物反應器的有效容積30 L，平板膜所需沖刷空氣6 L·(min·片)-1由位于膜組件下方的曝氣管提供，活性污泥所需的曝氣量設置為0.2 m3·h-1。反應器進水由液位繼電器(JYB-714，欣靈電氣公司)控制，平板膜的出水通過蠕動泵(BT600，保定蘭格公司)的連續(xù)抽吸來實現(xiàn)，裝置的工藝流程見圖1。MBR內接種污泥為該螺旋霉素制藥廢水處理站的二沉池濃縮污泥。課題組以往研究結果表明，采用MBR工藝處理該螺旋霉素廢水時，HRT=30～36 h可取得較好效果[11]，據此，本研究中HRT分別設定為40 h和30 h，考察水質指標處理效果相近的情況下，不同HRT對出水腸球菌耐藥性及抗性基因的影響。實驗室MBR系統(tǒng)共運行7個月，污泥停留時間(sludge retention time, SRT)均為30 d。設置初始HRT=40 h，在滿足MBR設備運行時間達到1個污泥齡以上，并且出水COD、氨氮等指標穩(wěn)定在20 d以上，視為系統(tǒng)達到穩(wěn)定運行狀態(tài)，可以取樣研究。

圖1 板式MBR處理螺旋霉素廢水試驗的工藝流程圖

1.3 水質分析

根據國家標準方法[12]對常規(guī)指標(混合液懸浮固體濃度(MLSS)、混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度(MLVSS)、COD、氨氮)進行檢測。

1.4 樣品總DNA提取

取MBR進水與出水提取基因組DNA。由于污水樣品為泥水混合物，為了使泥水能夠分離，同時又不會把水樣中的微生物沉淀下去，并考慮到泥水混合物中大顆粒物與微生物的沉降速度不同，故通過低速離心使其分離，根據MBR進水與出水的水質不同分別取20～100 mL經過0.22 μm濾膜過濾，將濾膜剪碎，采用試劑盒Fast DNA Spin Kit for soil (USA)對濾膜上截留的生物量提取基因組總DNA。提取的DNA溶液在Nanodrop分光光度計(Nanodrop，US)上測定濃度和質量，并進行瓊脂糖凝膠電泳(TBE緩沖液，質量體積比1%)。

1.5 樣品中總異養(yǎng)菌和腸球菌的檢測

異養(yǎng)菌總數(shù)采用R2A培養(yǎng)基進行培養(yǎng)計數(shù)[10]，用1 mL滅菌移液吸管吸取污水樣品1 mL，緩慢注入含有9 mL滅菌PBS緩沖液的試管內，震蕩試管混合均勻，制成10-1稀釋菌液。同法依次連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5稀釋菌液。每個采樣點水樣選擇3個適宜稀釋度，每個稀釋梯度做3個平行樣，吸取0.1 mL稀釋菌液，加在已經倒入滅菌培養(yǎng)基并凝固備用的平板上。涂布法涂布均勻，37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后計數(shù)，以上無菌操作均在超凈臺中進行。

腸球菌數(shù)采用濾膜法測定[13]，污水樣品同上經過稀釋，不同采樣點的樣品采用PBS緩沖液稀釋成適宜的稀釋液，用孔徑0.45m醋酸纖維濾膜過濾，將濾膜以截留面朝上貼附在滅菌濾膜腸球菌培養(yǎng)基并凝固備用的平板上，平板倒置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，根據菌落生長情況確定培養(yǎng)時間(t)。計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)，并根據稀釋倍數(shù)計算樣品中腸球菌的豐度。挑取乳白色菌落劃線于膽鹽七葉苷瓊脂培養(yǎng)基上，挑取有棕色光澤的菌落保存進行下一步實驗。

1.6 腸球菌耐藥性分析

通過藥敏實驗分析腸球菌耐藥性，采用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的Kirby-Bauer紙片法[14]，將待檢菌株菌液的濁度用無菌生理鹽水調節(jié)至0.5麥氏濁度后，用棉簽蘸取菌液涂布于Muller-Hinton瓊脂(Oxoid)平板上，貼上4種抗生素藥敏紙片(Oxoid)：阿奇霉素(AZI)、紅霉素(ERY)、螺旋霉素(SP)、克拉霉素(CLR)。將平板倒置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，采用CLSI標準判斷菌株的抗性，本研究以ATCC25922菌株為質控菌株。

1.7 抗性基因和轉移元件的檢測

1.7.1 抗性基因的定量檢測

采用SYBR-Green實時定量PCR方法對基因組DNA的ermB、ermF、ermX、mefA、ereA、mphB和轉移元件ISCR1、intI1、Tn916/1545進行定量分析，PCR所用引物見表1。檢測儀器為StepOne型熒光定量PCR儀(ABI，7500，美國)。PCR產物經過克隆測序確認后，使用生工質粒提取試劑盒SK1131從陽性克隆子中提取質粒，用作標準曲線。使用NanoDrop微量分光光度計(Nanodrop 2000-Thermo，美國)測定質粒濃度。制作標準曲線時按照10倍梯度稀釋構建好的各質粒，于90L稀釋液中加入10L質粒，做4～6個點，通過預試驗選取合適標準品用于制備標準曲線。標準質粒、環(huán)境樣品、陰性對照均做3個平行，取平均值進行計算。

載體(pMD 18-T)堿基數(shù) = 2 692 bp，載體(pGEMX-T Easy)堿基數(shù) = 3 023 bp

1.7.2 腸球菌攜帶抗性基因的檢測

采用菌液PCR的方法檢測腸球菌攜帶的抗性基因ermB、mefA和轉移元件intI1，基因引物見表1。菌液PCR采用20L反應體系：10L Taq PCR Master Mix (Biomed, Beijing)，0.5L引物(F)，0.5L引物(R)，菌液0.5L，加ddH2O至20L。反應程序為：94 ℃,15 min；94 ℃,30 s，55 ℃,30 s，72 ℃,1 min，34次循環(huán)；72 ℃,5 min，并于4 ℃保存。每次運行使用無菌水做陰性對照，PCR產物以1%的瓊脂凝膠電泳分析。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 不同HRT時MBR的運行效果

不同HRT條件下，MBR的常規(guī)檢測指標如表2所示。由于本研究是基于課題組以往對于MBR處理螺旋霉素廢水優(yōu)化后的工藝條件[11]，出水水質相對較為穩(wěn)定。由表中數(shù)據可知，在HRT分別為40 h與30 h的運行過程中，MBR內進出水水質變化不大，出水COD差值僅為11 mg·L-1，氨氮差值小于3 mg·L-1。HRT為30 h時，COD與氨氮的去除率分別為74.3%和97.7%，略高于HRT為40 h時的72.1%與96.2%。污泥濃度MLVSS在HRT為30 h比40 h高出9.5%，這主要是由于短HRT條件下，污泥有機負荷更高(HRT為30 h和40 h時污泥負荷分別為0.05 kgCOD·(kgVSS·d)-1和0.04 kgCOD·(kgVSS·d)-1，更有利于微生物的增殖。

2.2 HRT對總異養(yǎng)菌和腸球菌的去除效果的影響 HRT=40 h時，進水與出水中異養(yǎng)菌分別為5.60×108CFU·L-1和7.02×107CFU·L-1，腸球菌分別為1.13×104CFU·L-1和1.00×102CFU·L-1(見圖2)。MBR對總異養(yǎng)菌和腸球菌有較好的去除效果，去除率分別達到87.5%和99.1%。HRT=30 h時，進水中總異養(yǎng)菌和腸球菌的含量分別為2.29×108CFU·L-1和7.73×107CFU·L-1，出水中異養(yǎng)菌和腸球菌的濃度則為9.06×103CFU·L-1和1.60×102CFU·L-1，總異養(yǎng)菌和腸球菌去除率分別為66.2%和98.2%。Novo等[19]對比了不同HRT的城市污水處理廠(處理工藝分別為活性污泥法、滴濾池、淹沒式曝氣濾池)，發(fā)現(xiàn)長HRT的污水處理廠對進水中的總異養(yǎng)菌、腸球菌、耐藥腸球菌的去除效果均優(yōu)于短HRT的污水廠，認為長HRT更利于微生物菌群的均勻分布，因此總細菌和所有耐藥菌的去除效果均優(yōu)于短HRT。本研究結果與之相似，長HRT更有利于MBR工藝去除螺旋霉素廢水中的異養(yǎng)菌與腸球菌。

表1 抗性基因和轉移元件所用引物序列Table 1 Primers for resistance genes and mobile elements

表2 MBR進出水水質特征(平均值±標準差)Table 2 Characteristics of influent and effluent of MBR (means±SD) (mg·L-1)

注：MLSS為混合液懸浮固體濃度，MLVSS為混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度。

Note: MLSS stands for mixed liquor suspended solids, MLVSS stands for mixed liquor volatile suspended solids.

圖2 MBR工藝處理過程中異養(yǎng)菌和腸球菌的濃度變化

2.3 HRT對腸球菌耐藥率的影響

當HRT=40 h時，從樣品中分離出95株腸球菌(進水44株，活性污泥樣品20株，出水31株)分別對大環(huán)內酯類抗生素阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、螺旋霉素進行藥敏實驗。進水中腸球菌對大環(huán)內酯類4種抗生素的耐藥率分別為98%、93%、93%、75%，出水中耐藥率都有明顯的下降(見表3)，耐藥率分別為51%、54%、52%、39%。與進水腸球菌耐藥率相比，MBR裝置的活性污泥中腸球菌對紅霉素和螺旋霉素的耐藥率分別降低了18%和10%，對阿奇霉素和克拉霉素的耐藥率則變化不大，僅分別降低了3%和升高了2%。當HRT=30 h時，共分離出了101株腸球菌(進水50株，活性污泥樣品19株，出水32株)。MBR進水中腸球菌對阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、螺旋霉素4種抗生素的耐藥率均為100%，活性污泥樣品中腸球菌的耐藥率與進水腸球菌耐藥率近似，為98%～100%，出水中腸球菌的耐藥率分別為78%、79%、80%、82%。

由研究結果可知，不同水力停留時間的MBR處理工藝對大環(huán)內酯類4種抗生素的耐藥率均有顯著的削減效果。但在HRT為40 h時，MBR工藝出水中腸球菌耐藥率下降了36%～47%；HRT降到30 h時，出水腸球菌的耐藥率只比進水下降了18%～22%。此外，MBR活性污泥中的腸球菌在長HRT條件下對紅霉素與螺旋霉素的耐藥率更低。根據Kim等[20]的研究結果，活性污泥的有機負荷增加可導致四環(huán)素耐藥菌的增加。本研究中短HRT條件下MBR內的污泥負荷更高，更有利于MBR內耐藥腸球菌量增加，從而導致出水腸球菌耐藥率相對較高。

表3 HRT對腸球菌耐藥率的影響Table 3 The resistance rate of enterococci at different HRT

2.4 HRT對腸球菌攜帶的抗性基因削減效果影響

不同水力停留時間下分離出的腸球菌攜帶的抗性基因如表4所示。已有文獻報道ermB抗性基因的檢出率高于MLS其他抗性基因的檢出率[16,21]。本研究中分離出來的腸球菌ermB的攜帶率較高，而PCR結果均對mefA和intI1呈陰性。與Luna等[22]在臨床分離出的腸球菌中檢測到抗性基因mefA不同，我國的研究者在臨床分離的腸球菌中未檢測出mefA[23-24]，或mefA檢出率非常低[25]，本研究也未檢測出攜帶mefA的腸球菌，mefA檢出率低可能是我國環(huán)境中腸球菌的一個抗性污染特征。當HRT=40 h時，MBR進水、活性污泥、MBR出水樣品中腸球菌攜帶的抗性基因ermB檢出率分別為88.5%、90.0%、48.4%，而HRT=30 h時的檢出率分別為86.0%、89.4%、56.3%。出水腸球菌中ermB的檢出率分別下降了40.2%和29.8%，當HRT縮短后，出水中腸球菌攜帶的ermB檢出率明顯增加。

2.5 HRT對基因組DNA中抗性基因相對豐度的影響

通過將各抗性基因歸一化到16S rRNA，考察了抗性基因在MBR工藝處理螺旋霉素制藥廢水過程中的相對豐度變化(見圖3)。由圖3可知，進水中ermB和ermF的相對豐度最高。已有文獻報道，ermB是在腸球菌中檢出率較高的MLS抗性基因[26-27]，并且腸球菌獲得ermB基因是導致其對紅霉素高水平耐藥的主要原因[21]。ermB和ermF的相對豐度高，一個原因是宿主廣泛，覆蓋了革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)、好氧菌和厭氧菌[28]，另外也可能是由于這些基因常常與結合型或非結合型轉座子和質粒等轉移元件易于傳播有關[29]。

當MBR工藝以HRT=30 h運行時，抗性基因的豐度變化如圖3(a)所示，ereA、ermX、mefA、mphB和轉移元件Tn916/1545、ISCR1的豐度下降了15.2%～94.3%，而ermB、ermF和intI1的豐度在MBR處理之后均出現(xiàn)了反彈，增加了19.5%～38.0%。MBR工藝為HRT=40 h時(見圖3(b))，除intI1的豐度增加25.2%之外，其他的抗性基因和轉移元件豐度均成下降趨勢，下降范圍為24.8%～99.0%。整體來說，MBR工藝在長HRT條件下運行對抗性基因的削減效果更好。這可能是由于短HRT條件下，MBR內污泥濃度與污泥負荷更高，有利于耐藥菌的增殖，從而導致出水抗性基因相對長HRT時更多。

表4 腸球菌攜帶抗性基因的檢測結果Table 4 Detection of antibiotic resistance genes in enterococci

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

Note:+ positive; - negative.

圖3 不同HRT時抗性基因和轉移元件的相對豐度變化

雖然目前對于污水廠出水并無耐藥菌與抗性基因的要求，但是考慮到抗性污染傳播將給人類健康帶來的巨大風險，建議在今后實際污水處理過程中，應綜合考慮出水常規(guī)指標與抗性污染控制來選擇工藝操作參數(shù)，在經濟條件允許的情況下，選擇能夠達到出水常規(guī)指標要求，又能減少出水中耐藥菌與抗性基因的工藝條件，以期控制抗性污染傳播。

本研究考察了不同HRT條件下MBR處理螺旋霉素廢水過程中對腸球菌耐藥性與抗性基因的去除效果，結論如下：

(1)當HRT分別為40 h與30 h時，MBR出水水質較為接近，HRT為30 h時，COD與氨氮的去除率分別為74.3%和97.7%，略高于HRT為40 h時的72.1%與96.2%。

(2)長HRT更有利于去除螺旋霉素廢水中的總異養(yǎng)菌和腸球菌，出水中腸球菌耐藥性、腸球菌攜帶抗性基因的檢出也更低。此外，出水中6種抗性基因ermB、ermF、ermX、mefA、ereA、mphB和3種轉移元件ISCR1、intI1、Tn916/1545在長HRT條件下也得到更好的去除。

(3)短HRT時MBR內污泥濃度與污泥負荷更高，有利于耐藥菌的增殖，可能是導致出水抗性基因和耐藥菌比長HRT時更多的原因之一。

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Reduction of Antibiotic Resistant Bacteria and Genes in Spiramycin Wastewater Treated by Membrane Bioreactor (MBR) Process

Qin Caixia1,2, Zhang Junya1, Tong Juan1,*, Shen Peihong2, Wei Yuansong1,3

1. State Key Joint Laboratory of Environmental Simulation and Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China 3. Institute of Energy, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China

Received 19 September 2015 accepted 11 December 2015

Antibiotics production wastewater contains large amounts of antibiotic resistant bacteria (ARB) and antibiotic resistance genes (ARGs), and the treated wastewater would improve the antibiotic resistance of the environmental bacteria. It is necessary to investigate the reduction of ARB and ARGs during the treatment of antibiotics production wastewater. In this study, the spiramycin production wastewater was treated by membrane bioreactor (MBR), and the removal of ARB and ARGs under two hydraulic retention times (HRT) were investigated. The results revealed that the COD and NH4+-N removal performances were slightly higher at HRT 30 h than at 40 h, however, the removals of total heterotrophic bacteria and enterococci were better at HRT 40 h, as well as the antibiotic resistance rate of enterococci, and the detection of ARGs carried by enterococci were lower at HRT 40 h. Furthermore, the relative abundances of ARGs (ermB, ermF, ermX, mefA, ereA and mphB) and mobile elements (ISCR1 and Tn916/1545) were reduced more at HRT 40 h than at 30 h. These results indicated that longer HRT for MBR treating spiramycin wastewater would achieve better removal efficiencies of the ARB and ARGs.

membrane bioreactor (MBR); antibiotic resistant bacteria (ARB); antibiotic resistance genes (ARGs); spiramycin wastewater; hydraulic retention time (HRT)

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07203-002)；國家自然科學基金項目(21207147)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303091)

覃彩霞(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為資源與環(huán)境微生物，E-mail: qincaixia1990@163.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: hittj@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150919001

2015-09-19錄用日期：2015-12-11

1673-5897(2015)5-100-08

X171.5

A

佟娟(1977—)，女，博士，助理研究員，主要研究方向為污水/污泥處理與資源化利用技術，污水/污泥處理過程中的抗性污染研究。

覃彩霞, 張俊亞, 佟娟, 等. MBR工藝處理螺旋霉素制藥廢水過程中抗生素耐藥菌與抗性基因的研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(5): 100-107

Qin C X, Zhang J Y, Tong J, et al. Reduction of antibiotic resistant bacteria and genes in spiramycin wastewater treated by membrane bioreactor (MBR) process [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 100-107 (in Chinese)