田家亮，簡月奎，李建揚(yáng)

（貴州省人民醫(yī)院骨科，貴陽550001）

骨缺損是骨外科手術(shù)中經(jīng)常遇到的難題，自體骨移植具有取材有限、取材部位易發(fā)生并發(fā)癥的缺點(diǎn)。異體骨移植來源受限，且有傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，近年來，異種骨移植成為了研究熱點(diǎn)，但由于異種骨具有抗原性，移植后可能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，因此在使用前需要進(jìn)行去抗原處理。在異種骨中的除抗原處理中，酶法脫蛋白處理已經(jīng)成為近來研究的熱點(diǎn)，胰蛋白酶是一種非特異性消化酶，可以消化異種骨表面的包括MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ抗原在內(nèi)的異種骨抗原［1］，相對于強(qiáng)氧化劑，酶的水解過程溫和，不會(huì)對骨中無機(jī)成分的結(jié)構(gòu)造成破壞［2］。傳統(tǒng)的胰蛋白酶水解蛋白需要12h或更長的作用時(shí)間，近年來研究發(fā)現(xiàn)，超聲波能在一定條件下增加胰蛋白酶的活性，增加其水解蛋白的速度［3］?？梢詫⒁鹊鞍酌杆獾鞍椎淖饔脮r(shí)間縮短至數(shù)分鐘，而且其分解較為完全。本研究采用超聲波輔助胰蛋白酶的方法對豬異種骨去抗原處理，探討其的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 超聲波細(xì)胞破碎儀（美國），超臨界CO2流體設(shè)備 （德 陽 ），JSM－5900 型 掃 描 電 子 顯 微 鏡 （日 本 ），INSTRON8874生物力學(xué)測試系統(tǒng) （美國）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系內(nèi)江豬一頭，雄性，8月齡。無菌條件下取股骨干骺端帶皮質(zhì)松質(zhì)骨，制成0．5cm×0．5cm×0．5 cm大小顆粒骨，去除周圍軟組織及骨膜。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)骨材料處理方法的不同，分成4組。A組：超臨界脫脂＋深低溫冷凍＋超聲輔助酶法。蒸餾水反復(fù)沖洗骨及髓腔內(nèi)物質(zhì)；用超臨界CO2（16～18kg／h的CO2流動(dòng)率，壓力為25MPa，溫度為50℃，時(shí)間為骨的10g／min）脫脂［4－6］；雙 蒸 水 沖 洗 12h；－80 ℃ 深 低 溫 冷 凍 保 存 1 個(gè)月，－20℃、4℃梯度復(fù)溫；37℃，pH值為8條件下，超聲波輻照（功率1 200kW）下0．25%胰蛋白酶消化30min（超聲波每工作30s，停止工作10s）［3－4］。B組：超臨界脫脂＋深低溫冷凍＋超聲脫細(xì)胞。C組：超臨界脫脂＋深低溫冷凍＋胰蛋白酶。D組：新鮮骨；無菌生理鹽水反復(fù)沖洗骨及髓腔內(nèi)物質(zhì)；無菌濕紗布包裹，放置－20℃冰箱中備用。A、B、C組標(biāo)本處理完成后，真空低溫冷凍干燥機(jī)凍干，真空包裝袋密封，25kGy的Co60輻射消毒備用。

1．4 檢測指標(biāo)

1．4．1 材料的大體標(biāo)本觀察及切片組織形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察所制備的各組異種骨移植材料的形貌特征和結(jié)構(gòu)，并將材料用LEICA2500E型切片機(jī)制成5μm厚的硬組織切片，HE染色觀察材料處理后骨組織學(xué)形態(tài)。

1．4．2 各組骨材料異種抗原的檢測 分別檢測各組骨材料a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和 MHC－Ⅱ抗原的表達(dá)，細(xì)胞核蘇木素復(fù)染，DAB顯色，光鏡下觀察不同處理組a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和MHC－Ⅱ抗原分布及強(qiáng)弱情況變化。

1．4．3 掃描電鏡觀察各組骨材料孔徑大小和孔徑率 用JSM－5900型電子顯微鏡對上述制備的材料進(jìn)行掃描電鏡觀察，每種材料4個(gè)樣品，并用JSM－5900型數(shù)字圖像分析系統(tǒng)對其孔徑大小和孔隙率進(jìn)行測定，加速電壓20kV。

1．4．4 材料的力學(xué)性能測定 INSTRON8874生物力學(xué)測試系統(tǒng)對所制備的各組材料分別進(jìn)行軸向壓縮。常溫常壓下，壓縮實(shí)驗(yàn)加載速度0．5mm／min，應(yīng)力下降25%～70%停止加載，函數(shù)記錄儀記錄載荷－變形曲線。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用x±s表示，各組間比較采用方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 材料的大體標(biāo)本及組織形態(tài)學(xué)觀察

2．1．1 材料的大體標(biāo)本比較 A組：骨材料呈白色，微孔壁光滑，具有天然骨的三維結(jié)構(gòu)。B組：骨材料呈淡黃色，微孔壁欠光滑；C組：骨材料呈淡黃色，微孔壁光滑。D組：含有大量血細(xì)胞和脂肪組織，微孔壁大部分被血細(xì)胞和脂肪組織充填。

2．1．2 材料的組織形態(tài)學(xué)比較 A組：骨組織中骨小梁結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，骨陷窩和Harversian管周圍無細(xì)胞存留。B組：骨陷窩和Harversian管周圍仍可見較多細(xì)胞存留，細(xì)胞核藍(lán)染。C組：骨陷窩和Harversian管周圍可見少量細(xì)胞存留。D組：骨陷窩和Harversian管周圍可見大量細(xì)胞存留。見圖1。

圖1 各組形態(tài)學(xué)（HE×200）

2．2 掃描電鏡觀察 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的各組材料均具有多孔的三維骨結(jié)構(gòu)，新鮮骨孔隙被大量血細(xì)胞和脂肪組織所覆蓋。各組間孔徑大小比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。各組孔隙率比較，從大到小順序?yàn)锳組、C組、B組、D組，A、C組相似（P＞0．05），其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見表1。

2．3 免疫組織化學(xué)檢測各組a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和 MHC－Ⅱ抗原 A組無抗原陽性表達(dá)。B組骨細(xì)胞表面可見a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和MHC－Ⅱ抗原的陽性表達(dá)，骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞表面和Harversian管周圍褐色的顆粒沉積。C組骨細(xì)胞表面可見少量a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和 MHC－Ⅱ抗原的陽性表達(dá)。D組骨細(xì)胞表面可見大量a－Gal抗原、MHC－Ⅰ和 MHC－Ⅱ抗原的陽性表達(dá)，骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞表面和Harversian管周圍褐色的顆粒沉積。見圖2。

表1 各組材料處理后的孔隙率和孔徑大?。▁±s）

圖2 各組免疫組織化學(xué)檢測（×200）

2．4 材料的生物力學(xué)性能 最大載荷A組明顯小于B、C、D組（P＜0．05），C組與B、D組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而B、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。最大應(yīng)力A組最小，A組與B組、A組與D組之間最大應(yīng)力差別明顯（P＜0．05），其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。彈性模量各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見表2。

表2 各組材料生物力學(xué)性能比較（x±s）

3 討 論

異種骨作為骨移植材料最大的障礙在于其抗原性，植入體內(nèi)后可能會(huì)引發(fā)移植免疫排斥。在異種骨中的除抗原處理中，酸堿法因?yàn)槠茐牟牧系纳锪W(xué)性能，已較少使用，而酶法脫去抗原因?yàn)閷Σ牧系纳锪W(xué)性能破壞較小，已經(jīng)成為近來研究的熱點(diǎn)，傳統(tǒng)的胰蛋白酶水解蛋白需要12h或更長的作用時(shí)間，才能去除材料中的抗原成分，超聲波能在一定條件下可以增加胰蛋白酶的活性，增加其水解蛋白的速度［3］。本研究按照Rial－Otero等［7］的方法采用超聲波輔助胰蛋白酶消化異種骨蛋白的方法來去除異種骨中的抗原，經(jīng)過免疫組織化學(xué)的方法檢測其骨中的抗原，結(jié)果表明超臨界CO2、深低溫冷凍、超聲輔助酶消化的異種骨中的抗原已完全被消化，其免疫原性最低，而經(jīng)超臨界CO2、深低溫冷凍、超聲波或胰蛋白酶處理的異種骨材料抗原性雖明顯降低，但仍可檢測到異種抗原。

除了免疫原性低以外，經(jīng)超聲輔助酶法處理后的異種骨材料，孔徑、孔隙率均比其他組高，與文獻(xiàn)報(bào)道的植入材料的最佳孔徑為100～500μm，孔徑相對大，孔隙率高的材料有利于直接成骨一致［8－10］。表明經(jīng)本法處理的異種骨材料具有更好的成骨傳導(dǎo)性。

另外，骨材料的生物力學(xué)特性也非常重要，在去抗原過程中，物理和化學(xué)的去抗原方法難免會(huì)影響到骨的生物力學(xué)性能。相對于強(qiáng)氧化劑，酶的水解對骨的生物力學(xué)影響小，不會(huì)對骨中無機(jī)成分的結(jié)構(gòu)造成破壞［11－12］。本研究證實(shí)經(jīng)超臨界CO2、深低溫冷凍、超聲波處理的異種骨和新鮮骨比較，其生物力學(xué)性能無顯著差異，表明超臨界CO2、深低溫冷凍、超聲波處理對骨的生物力學(xué)性能無顯著影響，而經(jīng)超臨界CO2、深低溫冷凍、胰蛋白酶處理后的異種骨，其生物力學(xué)性能顯著下降，表明酶處理對異種骨生物材料生物力學(xué)性能有顯著影響，經(jīng)超臨界CO2、深低溫冷凍、超聲輔助酶法處理后的異種骨生物力學(xué)性能最差，表明超聲輔助酶法對異種骨的生物力學(xué)性能的影響較大。

本研究結(jié)果表明，超聲輔助酶法去抗原處理異種骨，可以有效地去除異種中的抗原，但同時(shí)材料的生物力學(xué)性能有明顯的影響，還需要在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化參數(shù)，以達(dá)到既能去除異種抗原，又能使材料的生物力學(xué)性能獲得最大的保留的目的，為異種骨的臨床應(yīng)用開辟廣闊前景。

［1］ Kim BS，Mooney DJ．Development of biocompatible syn－thetic extracellular matrices for tissue engineering［J］．Trends Biotechnol，1998，16（5）：224－230．

［2］ 楊立華，王遠(yuǎn)亮．脫除異種骨中非膠原蛋白的研究［J］．高技術(shù)通訊，2005，15（4）：41－44．

［3］ Opez－Ferrer DL，Capelo JL，Azquez JV，et al．Ultra－fast trypsin digestion of proteins by high intensity focused ultrasound［J］．J Proteome Res，2005，4（5）：1569－1574．

［4］ Fages J，Marty A，Delga C，et al．Use of supercritical CO2 for bone delipidation［J］．Biomaterials，1994，15（9）：650－656．

［5］ Rouquet N．Histological integration of allogeneic cancellous bone tissue treated by supercritical CO2implanted in sheep bone［J］．Biomaterials，1998，19（24）：2247－2253．

［6］ Haimi S，Wahlman M，Mannila M，et al．Pulse－lavage washing is an effective method for defatting of morselized allograft bone in the operating theater［J］．Acta Orthop，2008，79（1）：94－97．

［7］ Rial－Otero R，Carreira RJ，Cordeiro FM，et al．Ultrasonic assisted protein enzymatic digestion for fast protein identification by matrix－assisted laser desorption／ionization time－of－flight mass spectrometry．Sonoreactor versus ultrasonic probe［J］．J Chromatogr A，2007，28（2）：101－107．

［8］ Soicher MA，Christiansen BA．Remineralized bone matrix as a scaffold for bone tissue engineering［J］．J Biomed Mater Res A，2014，102（12）：4480－4490．

［9］Bakhshalian N，Nowzari H，Ahn KM，et al．Demineralized dentin matrix and bone graft：a review of literature［J］．J West Soc Periodontol Periodontal Abstr，2014，62（2）：35－38．

［10］Campana V，Milano G，Pagano E，et al．Bone substitutes in orthopaedic surgery：from basic science to clinical practice［J］．J Mater Sci Mater Med，2014，25（10）：2445－2461．

［11］Matter HP，Garrel TV，Bilderbeek U，et al．Biomechanical examinations of cancellous bone concerning the influence of duration and temperature of cryopreservation［J］．J Biomed Mater Res，2001，55（l）：40－44．

［12］Kang Q，An YH，F(xiàn)riedman RJ．Effects of multiple freezing－thawing cyeles on ultimate indentation load and stiffness of bovine caneellous bone［J］．Am J Vet Re，1997，58（10）：1171－1173．