歐小波，周 密，冉啟梅

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)：1．病理學(xué)教研室；2．臨床醫(yī)學(xué)系，廣東珠海519041）

1998年，Yuan等［1］首次提出肝癌缺失基因1（deleted in liver cancer 1，DLC1）作為抑癌基因位于人類染色體8p21．3－22，其在肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)減少或缺失。Holeiter等［2］進(jìn)行的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞DLC1表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力增強(qiáng)，證明了DLC1能抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而RhoA－ROCK信號(hào)通路可參與細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移［3］，在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮一定作用［4］。但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移中DLC1與RhoA－ROCK通路之間的聯(lián)系，本文旨在應(yīng)用免疫組化（SP）法檢測(cè)DLC1和RhoA蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，探究DLC1與RhoA－ROCK通路對(duì)乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的影響，為乳腺癌患者的預(yù)后和靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 25例已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織標(biāo)本和30例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織標(biāo)本均由遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院病理科提供，患者臨床病例資料完整，均為女性，中位年齡為49歲。

1．2 試劑 兔源DLC1多克隆抗體（美國(guó) GeneTex），兔源RhoA多克隆抗體（北京博勝經(jīng)緯科技有限公司），免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液（博士德生物）。

1．3 方法 采用SP法，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。DLC1抗體以1∶750稀釋，RhoA抗體以1∶500稀釋。

1．4 結(jié)果判定 按陽(yáng)性細(xì)胞占所有癌細(xì)胞的比例和細(xì)胞顯色深淺分別對(duì)標(biāo)本進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分率：0%～15%細(xì)胞顯色為0分，＞15%～30%細(xì)胞顯色為1分，＞30%～50%顯色為2分，＞50%顯色為3分。（2）顯色深淺：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。二項(xiàng)乘積0分為陰性（－），1～2分為陽(yáng)性（＋），3～4分為中陽(yáng)性（＋＋），5～9分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用四格表χ2檢驗(yàn)比較各組間陽(yáng)性率，spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析DLC1與RhoA的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 DLC1和RhoA蛋白的表達(dá)情況 DLC1陽(yáng)性部位主要為細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，見(jiàn)圖1～2；RhoA陽(yáng)性部位主要為細(xì)胞漿，呈棕黃色，見(jiàn)圖3～4。其中已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病變組織與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病變組織相比，DLC1陽(yáng)性率降低（P＜0．05），RhoA陽(yáng)性率則升高（P＜0．01），見(jiàn)表1。

圖1 DLC1在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌病變組織中的表達(dá)（SP×100）

圖2 DLC1在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌病變組織中的表達(dá)（SP×200）

圖3 RhoA在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌病變組織中的表達(dá)（SP×200）

圖4 RhoA在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌病變組織中的表達(dá)（SP×200）

表1 DLC1與RhoA在兩組中的表達(dá)

2．2 DLC1和RhoA在乳腺癌病變組織中表達(dá)的相關(guān)性

spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示DLC1與RhoA在乳腺癌病變組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．454，P＜0．01），見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌病變組織中DLC1與RhoA表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

乳腺癌作為女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［5］，以淋巴道為主要轉(zhuǎn)移途徑，抑制乳腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是臨床上治療乳腺癌的重要手段，因此探索乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素對(duì)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和治療乳腺癌具有重大的意義。

DLC1由Yuan等［1］在原發(fā)性肝癌中首次分離和報(bào)道的，其功能結(jié)構(gòu)域主要有3個(gè)，分別是SAM、RhoGAP和START，其中RhoGAP被普遍認(rèn)為是抗腫瘤的主要結(jié)構(gòu)域［6］，其抗腫瘤的主要機(jī)制是使RhoGTPase活化，有活性的RhoGTP被轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的RhoGDP，從而使Rho失活，抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

RhoA是Rho蛋白家族中的一個(gè)小分子蛋白，其常見(jiàn)的下游靶效應(yīng)分子為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK），ROCK可接受RhoA轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化信號(hào)，參與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，從而改變細(xì)胞形態(tài)、影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遷移能力［7］。

已有研究報(bào)道，DLC1作為抑癌因子在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［8］。Roessler等［9］的研究發(fā)現(xiàn)DLC1表達(dá)缺失的肝癌患者預(yù)后情況較差，證明了DLC1是影響腫瘤患者預(yù)后的因素之一。在我國(guó)也有學(xué)者做了DLC1與腫瘤預(yù)后的相關(guān)研究，比如Feng等［10］采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織中DLC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DLC1與淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究采用SP法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的25例乳腺癌病變組織中，DLC1陽(yáng)性率為44．00%；而在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的30例病變組織中，DLC1陽(yáng)性率為73．33%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于無(wú)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織，DLC1在發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織中表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明DLC1在乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著抑制作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，RhoA在各種惡性腫瘤比如乳腺癌、宮頸癌等的轉(zhuǎn)移過(guò)程中充當(dāng)著極其活躍的角色［11－12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的25例乳腺癌病變組織中，RhoA陽(yáng)性率達(dá)92．00%，在30例未轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織中，RhoA陽(yáng)性率達(dá)50．00%，實(shí)驗(yàn)證明，RhoA在發(fā)生了轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織中表達(dá)明顯強(qiáng)于未發(fā)生轉(zhuǎn)移。

Wang等［13］在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移方面的研究顯示DLC1可以抑制Rho通路而降低乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，然而，關(guān)于乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移中DLC1與RhoA－ROCK通路之間的聯(lián)系國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病變組織相較于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的DLC1表達(dá)下調(diào)，而RhoA表達(dá)上調(diào)，spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，由此證實(shí)了DLC1作為RhoA蛋白的反向調(diào)控蛋白，可能通過(guò)下調(diào)RhoA的表達(dá)而抑制乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移。RhoA表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致ROCK接受的活化信號(hào)減弱，于是RhoA－ROCK信號(hào)通路的作用受到抑制，從而影響細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組［7］，降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移能力，因而抑制乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化檢測(cè)初步表明DLC1表達(dá)下調(diào)及RhoA表達(dá)上調(diào)跟乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，DLC1可能通過(guò)下調(diào)RhoA的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移。DLC1和RhoA很可能成為臨床抑制乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，至于彼此間具體的分子機(jī)制尚待從基因水平進(jìn)一步探究。

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