周雅菲，朱顯婷，鄧雨晴，周 威

（武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，武漢430023）

石菖蒲藥材來源于天南星科植物石菖蒲的根莖，味辛、苦，性溫，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功能；其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類（主要含單萜、倍半萜、苯丙素等）及苯甲酸類、多糖等［1］。本課題組成員前期研究表明，石菖蒲具有良好的抗抑郁效果［2］。但在現(xiàn)有研究中，石菖蒲的抗抑郁效應(yīng)集中在化學(xué)成分、效應(yīng)、單個成分的作用等層面，少有石菖蒲成分與抗抑郁效應(yīng)的關(guān)聯(lián)性研究［3－5］。本次研究是以“抗抑郁成分群”研究為核心，通過AB－8大孔樹脂制備石菖蒲不同洗脫部位，建立其高效液相特征圖譜，確認(rèn)圖譜特征峰及對應(yīng)特征峰之間的峰面積數(shù)據(jù)關(guān)系，并以小鼠懸尾、游泳等經(jīng)典行為學(xué)實驗為觀察項目，探討石菖蒲的特征化學(xué)成分組與抗抑郁效應(yīng)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 儀器、藥品與試劑 THERMO自動進(jìn)樣高效液相（FINNIGAN SURVEYOR，PDA 檢測器）；Milli－Q Integral超純水一體化智能系統(tǒng)制備（Merck Millipore）；手提式中藥粉碎機(jī)（型號：DFT－200，江陰市洲元藥化機(jī)械制造有限公司）；真空泵（型號：金葉SHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：RE－52AA，上海亞榮生化儀器廠）；超聲波振蕩器（型號：KH3200DB，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；真空干燥箱（型號：DZF6020，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（型號：B－260，上海亞榮生化儀器廠）；JY6001型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；1／100S電子秒表。95%乙醇購自武漢點達(dá)化工有限公司；色譜試劑甲醇購自Fisher公司；AB－8大孔樹脂購自天津波鴻樹脂科技有限公司；石菖蒲飲片（批號：20121106）購自武漢市神草中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢輕工大學(xué)生物制藥與工程學(xué)院陳平教授鑒定為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，藥材標(biāo)本現(xiàn)存于本實驗室。實驗用雄性昆明小鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（鄂）2004－0007，體質(zhì)量為（25±5）g。

1．2 方法

1．2．1 原藥材浸膏及不同極性部位制備方法 取石菖蒲原藥材粉碎過40目篩，加8倍量75%乙醇，浸泡30min，煮沸60 min，傾出藥液，壓濾；藥渣加入4倍量水，煮沸45min，濾過除渣。合并提取液，減壓濃縮并真空干燥制成藥材干浸膏，稱質(zhì)量。使用AB－8大孔樹脂，將粉碎后的石菖蒲藥材干浸膏用適量蒸餾水超聲溶解，定容至折算藥材量1g／mL，以1倍樹脂體積／小時上樣，以3倍樹脂體積／小時的洗脫速度，先后以3倍體積的水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇等進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮、減壓干燥制成干浸膏，稱質(zhì)量并編為AB－8不同濃度乙醇洗脫部位。根據(jù)干浸膏質(zhì)量與原藥材質(zhì)量比，折算成對應(yīng)原藥材質(zhì)量。

1．2．2 高效液相實驗 供試樣品制備實驗前取制備的原藥材及不同部位干浸膏，精確稱質(zhì)量，使用色譜甲醇溶解，超聲10 min后色譜甲醇定容；使用0．45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。色 譜 條 件 色 譜 柱 為 Agilent Eclipse XDB－C18（4．6mm×250．0mm，5μm）柱溫30℃，流速為1．0mL／min。采用流速：1．0mL／min，溶劑為甲醇（A）－0．01%甲酸水（B）。經(jīng)條件篩選，確定洗脫梯度為：5%甲醇60min 100%甲醇，樣品進(jìn)樣量固定為10μL，檢測波長以全波長（PDA，190～400 nm）。由于其1～5峰面積積分值總和占石菖蒲藥材PDA液相峰積分總面積80%以上，確定圖譜中峰為石菖蒲特征峰。石菖蒲原藥材液相特征圖譜見圖1。

圖1 石菖蒲藥材高效液相PDA圖譜

日內(nèi)及日間精密度實驗取室溫放置的石菖蒲原藥材供試液，按方法進(jìn)行液相試驗，日內(nèi)測定5次，測定各特征峰峰面積Asn，計算Asn平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），分析日內(nèi)精密度。連續(xù)測定5d，同法測定各特征峰的峰面積及計算Asn平均值和RSD，分析日間精密度。

石菖蒲藥材及AB－8不同洗脫部位特征峰自比較分析取的原藥材及AB－8不同洗脫部位的供試樣品，按照液相色譜條件進(jìn)行實驗，測定不同樣品各特征峰峰面積Asn，不同樣本平行測試5次。將不同樣本中各特征峰峰面積除以樣本對應(yīng)折算的原藥材質(zhì)量（Asn／m）得到對應(yīng)值Bin，以計算所得的原藥材Bin量值為基準(zhǔn)（100%），計算各洗脫部位不同特征峰的Bin值占原藥材對應(yīng)特征峰Bin值的百分比。見圖2。

1．3 小鼠用藥劑量及分組 根據(jù)藥典推薦劑量，取10g／d的人用劑量。小白鼠分成對照組、石菖蒲藥材組及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位組，每組10只，根據(jù)所確定用藥劑量，灌胃給藥。依據(jù)《中藥藥理實驗方法》［6］中動物與人體表面積比換算法，將其換算成20g小鼠用石菖蒲藥材量為26mg／d。根據(jù)藥材提取物干浸膏及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位干浸膏折算后對應(yīng)的原藥材量，藥液按0．1g／mL的原藥材濃度進(jìn)行配置。根據(jù)小鼠體質(zhì)量計算實際給藥量，1d分兩次灌胃給予。

1．3．1 小鼠懸尾實驗（TST） 根據(jù)文獻(xiàn)［2］，在各組小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，均按劑量要求灌胃給藥，每天2次；對照組給予同等體積的蒸餾水。連續(xù)給藥7d，并于實驗第1、3、7天進(jìn)行TST。在測試當(dāng)天第2次給藥1h后，用膠布將小鼠尾在距尾尖2cm處粘于懸尾平衡支架，勿使小鼠尾部扭曲折疊，使其頭部向下懸掛呈倒懸狀，頭部距離桌面15cm。每只小鼠懸尾6 min，前2min適應(yīng)，記錄后4min內(nèi)的累計不動時間（不動指小鼠除呼吸外所有肢體均不動）。

1．3．2 小鼠游泳實驗（FST） 根據(jù)文獻(xiàn)［2］，各組小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，均按劑量要求灌胃給藥，每天2次；對照組給予同等體積的蒸餾水。連續(xù)給藥7d，并于實驗第1、3、7天進(jìn)行FST。實驗前24h動物進(jìn)行游泳訓(xùn)練15min，并單籠飼養(yǎng)，禁食不禁水。實驗時將當(dāng)天第2次給藥1h后的小鼠單只放入直徑約18cm、水深18cm、水溫（25±1）℃的圓形容器內(nèi)，適應(yīng)2min后開始計算后4min內(nèi)累計不動時間（漂浮不動狀態(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身體不至沉下）。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以x±s表示，組間采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 石菖蒲液相特征峰精密度實驗 結(jié)果表明日內(nèi)及日間精密度良好。見表1。

表1 精密度實驗

表2 石菖蒲藥材及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位特征峰峰面積自比較分析

表3 石菖蒲藥材及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位對小鼠懸尾不動時間、游泳不動時間的影響（x±s）

2．2 石菖蒲藥材及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位特征峰自比較 結(jié)果表明，各特征峰在不同極性部位Bin值占石菖蒲原藥材對應(yīng)Bin值的百分比存在顯著差異。1～5號特征峰主要集中于90%乙醇洗脫部位，70%乙醇洗脫部位也有分布。50%乙醇洗脫部位只有特征峰1、2、4的分布，且相對比例低于15%。20%乙醇及水洗脫部位無特征峰分布。見表2。

2．3 TST、FST分析 從給藥第1天開始，同測試時間點石菖蒲藥材組、90%乙醇組、70%乙醇組與對照組比較，小鼠懸尾不動時間、游泳不動時間明顯縮短（P＜0．05）；各組小鼠懸尾不動時間第1、3、7天逐漸縮短；由于小鼠給藥量折合原藥材量一致，90%乙醇組、70%乙醇組能部分代表石菖蒲藥材的抗抑郁功能，而其他部位在藥典推薦劑量下幾乎無作用。見表3。

3 討 論

在同石菖蒲藥材折算計量的前提下，本次研究所確定的液相特征峰群在石菖蒲藥材及AB－8不同濃度乙醇洗脫部位表達(dá)有明顯差異，其在TST及FST中也表現(xiàn)出了不同效果。石菖蒲、AB－8樹脂90%及70%乙醇洗脫部位在藥典推薦劑量下有抗抑郁效應(yīng)，且90%部位強(qiáng)于70%部位。其效應(yīng)與特征峰具有特征相關(guān)性。90%乙醇洗脫部位集中了藥材中超過一半質(zhì)量（峰面積折算）的1～5特征峰對應(yīng)物質(zhì)；70%乙醇洗脫部位集中了近1／4質(zhì)量的1～5特征峰對應(yīng)物質(zhì)；而50%、20%乙醇及水的部位無法發(fā)現(xiàn)峰3、5對應(yīng)的峰。結(jié)合以上分析可知，1～5號峰群同時出現(xiàn)與石菖蒲的抗抑郁效應(yīng)具有良好的相關(guān)性，其抗抑郁效應(yīng)與其含量呈正相關(guān)；如缺失峰3、5的表達(dá)，則在藥典劑量下幾無抗抑郁效應(yīng)。證明對1～5號峰群的富集且全表達(dá)有利于石菖蒲抗抑郁效應(yīng)。

中藥是一個多種成分的復(fù)合體；科學(xué)合理的質(zhì)量控制方法是保證中藥質(zhì)量的前提和基礎(chǔ)?，F(xiàn)有很多研究運用高效液相等現(xiàn)代設(shè)備，建立相應(yīng)特征圖譜來描述及控制中藥質(zhì)量［7－9］。

本次研究依據(jù)“成分－效應(yīng)”相結(jié)合的思路，建立石菖蒲抗抑郁有效成分群的高效液相紫外特征譜，為今后的進(jìn)一步研究及確定中藥石菖蒲抗抑郁產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法提供借鑒。

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