沈 俊，宋志強，沈海山，聶義鑫，吳建臣，李勝文，△

（1．清華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，北京100083；2．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽550004；

3．清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，北京100016）

目前臨床沿用及改良的各種腸膀胱手術(shù)仍然存在術(shù)后不同程度并發(fā)癥，如感染［1］、代謝紊亂［2］、腸黏液增多堵塞尿道［3］、結(jié)石形成［4］及惡性腫瘤形成或復(fù)發(fā)［5］等，其原因在于腸膀胱具有分泌和吸收功能。為解決上述并發(fā)癥，作者選用家兔作為實驗對象，初步建立自體腹膜移植于去黏膜的回腸漿肌層重建膀胱的動物實驗?zāi)Ｐ?，探討其可行性，為進一步臨床實驗提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料及術(shù)前準備 選取健康成年大耳白雌兔7只，普通級，體質(zhì)量4．0～5．0kg，由清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準。所需特殊儀器設(shè)備及耗材試劑如下：一個雙目手術(shù)顯微平臺（上海：SXP－1C），上海精鐘的眼科手術(shù)精細器械一套（剪刀1把，鑷子2把，鉗子2把），F(xiàn)10雙腔氣囊尿管7根，F(xiàn)2．5硬膜外導(dǎo)管14根，4／0，6／0，8／0微喬／單喬線（ETHICON）各7個，免疫組織化學(xué)試劑盒2個（Calretinin／CK7），由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。在充分的術(shù)前腸道準備（術(shù)前24h禁食，不禁飲）及有效的麻醉下分別進行手術(shù)操作。

1．2 手術(shù)方法 全身靜脈麻醉后，面罩吸氧，簡易心電監(jiān)護。同時，仰臥位綁定動物，剪除家兔下腹部毛，裸露皮膚，常規(guī)碘伏消毒2次，鋪敷。沿下腹正中線切開皮膚、皮下、肌層直達盆腹腔，首先可見充盈的膀胱，大小約6．0cm×3．0cm×2．0 cm，抽取尿液拍照比對，在膀胱頂部盆腹腔之間尋及腹膜反折，剪取面積約4．0cm×2．5cm腹膜，區(qū)分正反面，浸入生理鹽水待用。切開膀胱，尋及兩側(cè)輸尿管開口，用F2．5硬膜外導(dǎo)管分別置入輸尿管上行8．0～10．0cm，其下端由尿道引出，并置入F10雙腔氣囊尿管。距回盲部約10cm處以近方向選取長約4cm回腸，血供良好。將回腸殘端用6／0單喬線對位間斷吻合，關(guān)閉系膜孔。將選取回腸段對系膜緣縱行剪開腸管，在一自制軟木板（面積約10．0cm×10．0cm）上平鋪開，并用大頭針固定腸壁邊緣，置于顯微鏡平臺下進行剝離腸黏膜及黏膜下層，僅留取漿肌層（圖1）。把選取的腹膜粗糙面貼于裸露的腸壁肌層上，用8／0微喬線間斷縫合固定邊緣。切除膀胱頂部及前壁部分（面積約3．0cm×2．0cm），尿管注水囊8～10 mL，將備好的腹膜腸壁覆蓋其上并與膀胱殘垣用6／0單喬線間斷縫合關(guān)閉膀胱。查無明顯出血，清點器械、敷料無誤，分別用生理鹽水和甲硝唑稀釋液沖洗腹腔及創(chuàng)面，關(guān)閉切口，術(shù)畢。術(shù)中給予頭孢呋辛0．75g（分2次）。外露尿管及輸尿管導(dǎo)管用膠布固定于家兔尾巴上。

圖1 回腸壁剝離層面（HE×10）

1．3 術(shù)后養(yǎng)護及管理 術(shù)后繼續(xù)禁食2d，不禁飲，補液200 mL／d，每分鐘20滴；術(shù)后2d常規(guī)使用抗菌藥物頭孢呋辛0．75g／d（分2次）；注意觀察輸尿管導(dǎo)管引流通暢情況，發(fā)現(xiàn)梗阻，即用慶大霉素稀釋溶液適度沖洗抽吸，保持通暢引流。在輸液過程中需要專人看護，避免動物抓咬輸液管道。術(shù)后第2天輸液完成之后麻醉下拔出尿管及雙側(cè)輸尿管導(dǎo)管，術(shù)后第3天給予半流質(zhì)飲食，術(shù)后第4天恢復(fù)正常飲食。術(shù)后4周與8周分別各安樂處死2只動物，再次打開盆腹腔，抽取膀胱內(nèi)尿液拍照與術(shù)前比對，切取膀胱標本送病理科行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢查。

2 結(jié) 果

7只動物手術(shù)基本順利完成（其中2只在剝離腸黏膜時破損失敗，行二次截取腸段再次剝離成功），術(shù)后3只動物分別于第3、4、5天自行咬出尿管及輸尿管導(dǎo)管，導(dǎo)致術(shù)后尿瘺感染死亡，1只動物術(shù)后第2天早上發(fā)現(xiàn)輸尿管導(dǎo)管堵塞無尿，引發(fā)急性腎盂腎炎和腎衰，立即用慶大霉素稀釋液沖洗并抽吸導(dǎo)管，使其通暢引流，搶救成功。剩余4只動物術(shù)后恢復(fù)良好，拔出尿管及輸尿管導(dǎo)管之后，觀察其排尿通暢，尿液黃清，未見明顯尿頻。術(shù)前與術(shù)后分別抽取尿液對比無明顯差異。術(shù)后4周安樂處死2只動物，見腸管吻合良好，通暢無梗阻，周圍粘連輕，膀胱周圍輕－中度粘連，打開膀胱見重建膀胱腸壁及附著腹膜存活，分界尚清（圖2），切除膀胱標本送病理檢查，分別進行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)（Calretinin）觀察，結(jié)果如圖3和圖4所示：移植腹膜與腸壁漿肌層連接緊密，染色及顯色區(qū)分明顯，未見明顯腸上皮及杯狀細胞再生。術(shù)后8周安樂處死另外2只動物，見術(shù)區(qū)盆腔中度粘連，切除并打開重建膀胱見吻合邊緣模糊，腹膜替代部分似被完整尿路上皮覆蓋（圖5），標本送檢。HE染色見表層上皮完整，細胞排列有序，與正常膀胱上皮類似，而且吻合處肌層交界明顯，見圖6；移植腹膜（間皮類特異染色Calretinin陰性）未見顯示，見圖7；漿肌腸段存活良好，其上覆蓋3～5層尿路移行上皮細胞（上皮類特異染色CK7強陽性），二者之間未見明顯腸上皮及杯狀細胞再生，見圖8。

圖2 術(shù)后4周重建膀胱腔內(nèi)吻合界面（箭頭示）

圖3 術(shù)后4周膀胱標本病理檢查（HE×10）

圖4 術(shù)后4周膀胱標本病理檢查（Calretinin×20）

圖5 術(shù)后8周重建膀胱腔內(nèi)吻合邊緣模糊（箭頭示）

圖6 術(shù)后8周重建膀胱腔內(nèi)表層（HE×20）

圖7 術(shù)后8周重建膀胱腔內(nèi)表層（Calretinin×40）

圖8 術(shù)后8周重建膀胱腔內(nèi)表層（CK7×40）

3 討 論

雖然腸膀胱手術(shù)技巧日臻完善，但用來修復(fù)膀胱的腸管本質(zhì)未變，因而手術(shù)后與其相關(guān)的分泌及吸收所致并發(fā)癥仍然困擾著臨床醫(yī)生與患者，盡管也有許多學(xué)者曾經(jīng)想到破壞腸黏膜的方法［6］，如用機械方法刮除黏膜，或用化學(xué)方法（無水乙醇／酶）破壞黏膜，以期減少腸黏膜的分泌與吸收，但效果均不盡如人意。相對于傳統(tǒng)方式而言，作者采用完整剝離腸黏膜及黏膜下層，并用自體腹膜移植覆蓋的方法，既可祛除術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥，又可保護剝離創(chuàng)面肌層免受尿液刺激。Turner等［7］建立動物模型取出膀胱黏膜上皮細胞在體外支架上進行培養(yǎng)擴增，然后再把該支架連同培養(yǎng)好的尿路上皮一起自體移植到一段帶血供的結(jié)腸（去上皮漿肌層）上進行膀胱成型術(shù)，獲得成功，但是，取出自體膀胱黏膜上皮細胞的局限性及培養(yǎng)時間較長，而且需二次手術(shù)可能，這就使得臨床實際應(yīng)用受限。另外，有研究報道［8－9］，可利用自體腹膜移植進行陰道重建，效果滿意。因此，作者認為自體腹膜移植于去黏膜的漿肌腸段重建膀胱理論上是可行的。本實驗的設(shè)計與初步建立家兔動物模型是成功的，通過手術(shù)前后家兔排尿行為及膀胱穿刺抽取尿液比較發(fā)現(xiàn)無明顯異常改變，說明重建膀胱無腸黏液的分泌、梗阻及感染征象；術(shù)后4周的病理切片檢查：常規(guī)HE染色與免疫組織化學(xué)Calretinin抗體（腹膜間皮類特異性抗體）特異陽性表達顯色，證實移植腹膜與漿肌回腸段附著緊密，存活良好，二者之間未見腸上皮再生。術(shù)后8周處死動物打開膀胱發(fā)現(xiàn)重建膀胱吻合邊緣模糊，有一層膜覆蓋，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢查證實移植腹膜消失，取而代之的是尿路移行上皮（Calretinin抗體染色陰性，上皮類特異性抗體CK7染色強陽性），僅有3～5層細胞，排列規(guī)則，說明此時移行上皮爬行修復(fù)初畢，上皮仍較薄。同樣，有學(xué)者在用犬腹膜重建黏膜剝脫輸尿管的實驗時發(fā)現(xiàn)術(shù)后10周腹膜間皮被成熟的移行上皮替代［10－11］。有關(guān)移植腹膜消失或轉(zhuǎn)化為尿路移行上皮的具體機制尚未明了，目前有兩種假說［12－13］，其一是周圍移行上皮細胞爬行長入，移植腹膜被上皮覆蓋吸收，其二是腹膜間皮化生所致。本實驗對此未作進一步研究。

對于腸黏膜剝離后是否會出現(xiàn)黏膜上皮再生以及繼續(xù)分泌黏液的問題，從理論上講只需將黏膜下層一并剝離，則不會出現(xiàn)黏膜再生與黏液分泌，因為黏膜再生的基礎(chǔ)和主要分泌黏液的杯狀細胞主要就在黏膜下層。有研究發(fā)現(xiàn)［14］，若將黏膜下層一起剝除會影響漿肌腸段的延展性，而切開漿肌層由外而內(nèi)在黏膜肌與黏膜下層面之間仔細剝離，在漿肌層面保留足夠多的黏膜下血管，這樣也可以避免腸黏膜再生，同時可以給移植物提供更好的滋養(yǎng)血管。但文中未提及杯狀細胞與黏液是否分泌的問題。本實驗是將黏膜與黏膜下層一并剝離，結(jié)果未見腸黏膜及杯狀細胞再生，重建膀胱內(nèi)無黏液分泌，尿液清亮。盡管剝離后漿肌腸段收縮相對明顯，但是術(shù)后伸展性良好，未見膀胱形態(tài)攣縮，分析其原因，可能與剝離黏膜時腸壁肌肉受刺激收縮，用腹膜覆蓋創(chuàng)面避免接觸尿液刺激，待其修復(fù)后延展性自然恢復(fù)。這和鄒建華等［15］的研究結(jié)果一致。

本實驗是用家兔作為實驗對象，由于其腸管細小，腸壁菲薄，作者選擇由腔內(nèi)向外剝離黏膜及黏膜下層，這也是本實驗難點所在，它不僅要求術(shù)者在顯微鏡下的熟練操作，而且需要助手的積極協(xié)調(diào)配合才能完成。Subramaniam等［14］研究提出，在尿管水囊的支撐吸附下從乙狀結(jié)腸管外剝脫漿肌層的方法更為優(yōu)越，因為它不打開腸腔，可以減少腸內(nèi)污物引起的感染，而且出血少，視野清晰，容易辨別剝離層次。他們用的實驗動物是豬，對于大型動物來說，腸壁較厚，從腔外剝除腸黏膜的確優(yōu)于從腔內(nèi)剝離黏膜。作者曾嘗試分別用豬的或家兔的腸管從腔外剝除腸黏膜，家兔的漿肌層菲薄，很難完整剝離獲取，而對豬的腸壁剝離就相對容易。對于導(dǎo)尿管的留置問題也很重要，尿管的水囊主要起支撐重建膀胱部分腹膜的作用，輸尿管導(dǎo)管是把尿液直接引出體外，避免過早浸泡刺激移植物創(chuàng)面。不同動物尿管留置時間要求不一樣，對于豬，要求留置尿管2周［7，14］，作者經(jīng)過試驗觀察，家兔術(shù)后留置導(dǎo)尿管時間最好不要超過2d。本實驗死亡3只均是由于留置尿管超過2d不能耐受，自行咬斷拔出，從而導(dǎo)致膀胱尿道受損，出現(xiàn)尿瘺，感染死亡。另外，家兔的修復(fù)能力很強，雖然只帶管引流2d，但術(shù)后檢查發(fā)現(xiàn)移植腹膜與漿肌腸段存活良好，結(jié)合緊密。

自體腹膜移植漿肌腸段重建膀胱家兔模型的成功建立，為下一步使用更加接近人體的大動物做進一步實驗研究奠定理論基礎(chǔ)，它也為腸代輸尿管的發(fā)展拓寬了思路，為這種新的手術(shù)方法可能在臨床的應(yīng)用提供最基本的實驗依據(jù)。

［1］ Shigemura K，Tanaka K，Arakawa S，et al．Postoperative bacteriuria，pyuria and urinary tract infection in patients with an orthotopic sigmoid colon neobladder replacement［J］．J Antibiot（Tokyo），2014，67（2）：143－145．

［2］ Vasdev N，Moon A，Thorpe AC．Metabolic complications of urinary intestinal diversion［J］．Indian J Urol，2013，29（4）：310－315．

［3］Ji H，Pan J，Shen W，et al．Identification and management of emptying failure in male patients with orthotopic neobladders after radical cystectomy for bladder cancer［J］．Urology，2010，76（3）：644－648．

［4］ Tiu A，Soloway MS．Giant neobladder stone［J］．ANZ J Surg，2014，84（5）：390－391．

［5］ Hadzi－Djoki J，Pejci T，Andrejevi V，et al．Transitional cell carcinoma in orthotopic ileal neobladder 12years after radical cystectomy［J］．Vojnosanit Pregl，2013，70（11）：1062－1064．

［6］ 高金龍，王曉雄，洪寶發(fā)，等．無水乙醇腸粘膜處理的實驗研究［J］．軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2006，27（4）：292－294．

［7］ Turner A，Subramanian R，David FM．Thomas，et al．Transplantation of Autologous Differentiated Urothelium in an Experimental Model of Composite Cystoplasty［J］．Eur Urol，2011，59（3）：447－454．

［8］ Ait Sakel A，Asseban M，Kallat A，et al．Vaginoplasty from peritoneal tube of Douglas′pouch for androgen insensitivity syndrome （two case reports）［J］．J Gynecol Obstet Biol Reprod（Paris），2014，43（6）：470－473．

［9］ 陳樹波，董麗霞．改良會陰H形切口在腹腔鏡下腹膜陰道成形術(shù)中的應(yīng)用［J］．中國修復(fù)重建外科雜志，2013，27（1）：69－71．

［10］Zhang J，Gu GL，Liu GH，et al．Ureteral reconstruction using autologous tubular grafts for the management of ureteral strictures and defects：an experimental study［J］．Urol Int，2012，88（1）：60－65．

［11］荊翌峰，夏術(shù)階，孫宏斌，等．游離腹膜管重建黏膜剝脫輸尿管的實驗研究［J］．中華泌尿外科雜志，2006，27（3）：174－176．

［12］荊翌峰，夏術(shù)階，李杜漸，等．利用游離腹膜重建犬黏膜剝脫輸尿管的遠期療效觀察［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，91（6）：412－414．

［13］Nannil L，Vallasciani S，F(xiàn)adda G，et al．Free peritoneal grafts for patch rethroplasty in male rabbits［J］．J Urol，2001，16（5）：578－580．

［14］Subramaniam R，Turner AM，Abbas SK，et al．Seromuscular grafts for bladder reconstruction：extra－luminal demucosalisation of the bowl［J］．Urology，2012，80（5）：1147－1150．

［15］鄒建華，南勛義，黨建功，等．膀胱粘膜點狀移植于漿肌層腸段重建膀胱的實驗研究［J］．中華泌尿外科雜志，1996，17（6）：364－367．