譚麗泉，余 梅，周 天，彭鎮(zhèn)宇

（廣東石油化工學院化學工程學院，廣東茂名525000）

隨著石油企業(yè)的飛速發(fā)展，石油類污染物對土壤的污染逐漸成為各個國家環(huán)境污染的一個重大的問題，大量石油污染物進入土壤，不但破壞土壤的質地和養(yǎng)分構成，而且還使其喪失可耕性與生物活性[1]，加上土壤的自凈能力有限，一旦受到破壞要讓其自然恢復就變得極為艱難。因此，采取有效措施，治理土壤石油污染顯得尤為迫切。

生物修復技術是土壤污染治理技術發(fā)展過程中的一個里程碑[2-6]。作為生物修復技術中的一員，用于污染物降解的白腐真菌，不僅具有廣譜、高效、低耗、適用性強等特點，而且對營養(yǎng)要求低、耐受性高，還能對其它微生物產生較強的拮抗作用，有著其它生物系統(tǒng)，特別是細菌系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點，受到世界各國科學界及工業(yè)界的高度重視[7]。前人利用其對染料廢水及多環(huán)芳烴等進行了處理，取得較好的效果[8-10]。本研究以白腐真菌作為降解菌，通過室內模擬實驗利用響應面優(yōu)化設計對白腐真菌降解石油的條件進行研究，以期找出白腐真菌降解土壤中石油的有利條件，為土壤石油污染微生物修復技術的應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 主要試劑及儀器

實驗所用石油取自茂名石化公司煉油廠，為黑色黏稠液體，160℃下恒溫蒸餾4h 后置于棕色試劑瓶中備用；NaH2PO4、硫胺素、石油醚（60～90℃）、正己烷、丙酮、藜蘆醇、Tween-80、苯甲醇和MgSO4·7H2O等試劑均為分析純，天津大茂化學試劑廠。

YXQ-LS-30S11 型立式壓力蒸汽滅菌器、THZ-92B 型氣浴恒溫振蕩器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LRH-150B 型培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；800 型離心機（上海精密科學儀器有限公司）；TU-1810 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RE-52CS 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 菌種

實驗所用白腐真菌（黃孢原毛平革菌（5.776））購自廣州微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基及菌懸液

PDA 固體養(yǎng)基：馬鈴200g·L-1，葡萄糖20g·L-1，KH2PO43g·L-1，MgSO4·7H2O1.5g·L-1，硫胺素8mg·L-1，瓊脂20g·L-1，麥麩15g·L-1，pH 值為6，蒸餾水1L。

供降解用的菌懸液配制：將經擴大培養(yǎng)并產生孢子的菌種從4℃冷凍保存的冰箱中轉入28℃培養(yǎng)箱中解凍復蘇后，于超凈工作臺上用無菌水倒入平板中輕輕搖蕩，使充分分散后轉入滅菌的三角燒瓶中，制成乳白色的孢子懸浮液，4℃保存[11]。

1.4 污染土壤的制備

實驗土壤取自廣東石油化工學院校無石油污染的土壤，用鋤頭挖取土層10cm 以下的土壤，風干后用40 目篩子過篩，把大塊的石頭和其它雜質去除后放于陰涼處備用[12]。根據一定土壤含油率往已稱重燒杯中加入適量土壤及石油，加入石油醚使其充分混合均勻后將石油醚揮發(fā)至恒重，算出土壤實際含油率。

2 實驗方法與分析方法

2.1 實驗方法[13]

2.1.1 單因素實驗 以土壤含水率、搖床轉速、土壤含油率、Tween80 及藜蘆醇為影響因子進行單因素研究，將降解體系在5 個錐形瓶中稱取含油率為8.0%的土壤6g，滅菌后加入2mL 菌懸液，加入適量的無菌水，在28℃、120r·min-1條件下恒溫培養(yǎng)9d，考察各因素對土壤中石油降解的影響，每組做兩個平行實驗。

2.1.2 響應面法優(yōu)化降解條件 根據單因素實驗結果，采用3 因素3 水平響應面Box-Behnken 設計，優(yōu)化土壤中石油降解條件，實驗因素及水平編碼如表1。

表1 因素及水平編碼表Tab.1 Test factors coding table

2.1.3 驗證實驗 根據軟件Design expert 7.0 分析得出的最佳水平組合進行驗證實驗，平行三次實驗得出平均值。

2.2 分析方法

2.2.1 白腐真菌生物量的測定采用細胞干重法[14]。

2.2.2 石油降解率的測定降解后的污泥體系高壓滅菌后，用200mL（1∶1）的正己烷/丙酮混合液索氏抽提48h 后旋轉蒸發(fā)至剩余5mL 液體，轉移到已稱重錐形瓶，將錐形瓶置于水浴鍋中以50℃把溶劑蒸干至恒重，錐形瓶增加的重量即為土壤中石油的重量。每組做一個無菌體系的空白實驗，以消除石油揮發(fā)所帶來的誤差。

2.2.3 石油降解率的計算

式中 G1：無菌體系石油含量；G2：有菌體系剩余石油含量。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 含水率對白腐真菌降解土壤中石油的影響5 個錐形瓶中稱取含油率為8.0%的土壤6g，滅菌后加入2mL 菌懸液，加入適量的無菌水調節(jié)其含水率分別為40%、50%、60%、70%、80%，28℃、120r·min-1條件下恒溫培養(yǎng)9d 后測其石油降解率。實驗結果見圖1。

圖1 含水率對土壤中石油降解的影響Fig.1 Effect of moisture content of petroleum in the soil degradation

由圖1 可知，不同含水率對白腐真菌降解石油有很大的影響。石油降解率先隨著土壤含水率的增加逐漸升高，含水率為40%時降解率只有32.4%；含水率為50%時降解率達到35.3%，而當含水率為60%時達到最大降解率40.7%，之后降解率隨著土壤含水率的增加而下降。實驗結果表明，土壤含水率在（40%～60%）的范圍內對石油的降解效果較好。土壤含水量對土壤中石油的微生物降解有很大的影響[15，16]，因為水會在土壤顆粒表面形成一層水膜，對石油與土壤顆粒間的聯(lián)系、吸附產生了阻礙，并形成了油水界面；而土壤中的微生物大多存在于油水界面，因此土壤含水量增多會增加微生物與石油的接觸，促進石油的降解；而土壤含水過低使微生物生長得不到充足的水分，細胞活性受到抑制，降解能力下降。但是土壤含水率過高又會造成土壤淹漬的現(xiàn)象，使土壤中的氧氣含量減少，而白腐真菌用于降解有機物的木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶必須首先與有氧條件下合成的H2O2反應才能實現(xiàn)有機物的降解，因此，對石油的降解產生影響。根據實驗結果，選用土壤含水率為60%進行后續(xù)實驗。

3.1.2 搖床轉速對白腐真菌降解土壤中石油的影響 準確稱取含油率為8.0%的土壤6g 至錐形瓶，滅菌后加入2mL 菌懸液，并加入適量的無菌水調節(jié)其含水率為60%，考察轉速0、40、80、120、160、200r·min-1對石油降解的影響，實驗結果見圖2。

圖2 搖床轉速對白腐真菌降解土壤中石油的影響Fig.2 Effect of rotation speed of petroleum in the soil degradation

由圖2 可知，白腐真菌降解石油的能力先是隨著搖床轉速的上升而逐漸升高，在轉速為160r·min-1時達到最大石油降解率36.68%，之后轉速增大降解率降低。這是由于振蕩培養(yǎng)條件下加速了營養(yǎng)物和氧氣在細胞間的傳質效率；同時振蕩速度越快，剪切力越強，形成的白腐真菌菌絲小球體積越小，增大了菌絲小球的表面積，和氧氣充分接觸，并獲取更多的營養(yǎng)物，促進了菌的生長及產酶，有利于石油的降解。而過高的轉速則會使菌體受到強的剪切力沖擊而死亡[17]。

3.1.3 土壤含油率對白腐真菌降解土壤中石油的影響 準確稱取含油率分別為1.6%、3.2%、8.0%、12.8%、20.0%的土壤6g 至5 個錐形瓶，滅菌后加入2 mL 菌懸液，調節(jié)體系含水率為60%，120r·min-1、28℃下恒溫培養(yǎng)9d 后測其石油降解率，實驗結果見圖3。

圖3 土壤含油率對白腐真菌降解土壤中石油的影響Fig.3 Effect of the oil content of petroleum in the soil degradation

由圖3 可知，石油降解率隨土壤石油含量的增大而增高，當石油含量達到8.0%時降解率達到最大值48.53%，之后隨著土壤石油含量的增多而下降，當土壤中的石油含量達到20.0%時降解率只有29.92%。石油濃度較低時可以作為碳源被白腐真菌利用，促進菌的生長，從而有利于石油的降解；而石油濃度過高會導致土壤中產生難分散的厚油層，使土壤中營養(yǎng)物和氧氣缺乏，菌的活性及降解能力都受到影響[18]。

3.1.4 Tween80 對白腐真菌降解土壤中石油的影響

因為土壤對石油有吸附性，會影響微生物對土壤中石油的降解。石油的增溶洗脫是微生物修復石油污染土壤的前提，因此選用了非離子型表面活性劑Tween80 做研究。往降解體系中加入Tween80，使其在體系中的濃度分別為2CMC、3CMC、4CMC、5CMC、6CMC（Tween80 的臨界膠束濃度CMC 值為14mg·L-1），加入2mL 菌懸液后置于搖床中恒溫培養(yǎng)后測其石油降解率，實驗結果見圖4。

圖4 Tween80 對白腐真菌降解土壤中石油的影響Fig.4 Effect of Tween80 of petroleum in the soil degradation

由圖4 可知，Tween80 在較低濃度時（＜4CMC）對石油降解的促進作用較明顯，在4CMC 時降解率達到了最大值51.33%，之后的石油降解率開始下降，6CMC 時只有26.71%。Tween80 屬于非離子型表面活性劑，不僅能增強土壤中石油的解吸作用，促進石油的降解，而且還充當了石油降解的共代謝底物，促進了白腐真菌的生長，從而提高了石油的降解率[19，20]。但是過高濃度（大于6CMC）的Tween80會對白腐真菌產生生物毒性，破壞其細胞膜的結構，甚至導致其死亡，從而影響石油的降解。

3.1.5 藜蘆醇濃度對白腐真菌降解土壤中石油的影響 改變體系中藜蘆醇濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g·L-1，滅菌后加入2mL 菌懸液，調節(jié)體系含水率為60%，120r·min-1、28℃下恒溫培養(yǎng)9d后測其石油降解率，實驗結果見圖5。

圖5 藜蘆醇濃度對白腐真菌降解土壤中石油的影響Fig.5 Effect of veratryl alcohol of petroleum in the soil degradation

由圖5 可知，隨藜蘆醇濃度的升高，石油降解率逐漸增大，在濃度為0.25g·L-1時達到最大值31.2%，之后降解率下降。在白腐真菌對有機物降解的次級代謝過程中產生了藜蘆醇（VA），而白腐真菌對石油的降解屬于間接氧化過程，需要一些易被木質素過氧化物酶（LiP）直接氧化成自由基的化學物質的幫助，此時藜蘆醇就充當了該氧化還原反應的電子調節(jié)者，誘導了酶的合成[21]。藜蘆醇既可以成為LiP的降解底物，又可避免LiP 因培養(yǎng)過程中產生的過量H2O2而失活。因此，在白腐真菌的降解反應體系中加入適量的藜蘆醇對石油的降解是有幫助的。

3.2 Box-Benhnken 實驗結果分析

依照單因素實驗的結果，以石油降解率（Y）為響應值，選取了實驗中降解率較高的Tween80（x1）、含水率（x2）、含油率（x3）3 個因素作為研究對象，根據Box-Behnken 中心組合原理，設計3 因素3 水平響應面分析實驗，每個因素分別取3 個水平，以（-1，0，1）編碼進行3 因素3 水平的組合實驗設計，實驗設計見表1，實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計條件及結果Tab.2 Response surface experimental design and results

對表2 中響應值進行二元回歸擬合，獲得石油降解率對泥土體系的Tween80（x1）、含水率（x2）和含油率（x3）的多元二次回歸方程：

并且該模型的R2=0.89996，P=0.0000＜0.05，說明模型與實際實驗擬合度較好，自變量和響應值之間關系顯著。

表3 響應面二次模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance and regression for the quadratic model

由表3 的P 值和F 值可知，在選取的各因素的水平范圍內，其對石油降解率的影響大小依次為：含油率＞含水率＞Tween80。其次，由表3 的P 值數據可知，在交互作用下，X2X3顯著，而X1X2和X1X3交互作用不顯著，即含水率和含油率的交互作用明顯。根據回歸方程做出響應面，考察擬合響應曲面的形狀，分析含油率、含水率、ween80 對石油降解率的影響，結果見圖6～8。

圖6 含水率與Tween80 交互作用的響應面曲面圖Fig.6 Response surface of interaction between moisture content and Tween80

由圖6 知，隨著含水率和Tween80 的增加石油降解率出現(xiàn)先升后降的變化趨勢，但通過仔細觀察可以發(fā)現(xiàn)，含水率的變化較Tween80 陡峭。

由圖7 知，含油率的變化較為陡峭，而Tween80的變化則相對平滑。

圖7 含油率與Tween80 交互作用的響應面曲面圖Fig.7 Response surface of interaction between oil content and Tween80

圖8 含油率與含水率交互作用的響應面曲面圖Fig.8 Response surface of interaction between oil content and moisture content

由圖8 知，事實上含油率的變化較含水率陡峭，也就是說實際上含油率的影響比含水率大，這也就與表3 的分析相對應。

經過模型優(yōu)化，得到預測模型為X1=-0.0714、X2=-0.2903、X3=0.05539 的點（即在Tween80 為2.93 cmc，土壤含水率為58.2%，土壤含油率為8.27%），并且該點具有石油降解的預測最大值60.04%。但考慮到實驗的可行性將各因素的值調整為Tween80=2.93CMC、壤含水率=58%、土壤含油率=8.27%，在上述實驗條件下驗證該實驗，做3 組平行實驗，石油降解率分別為58.64%，59.54%，57.86%，平均值為58.68%，與預測值偏離較小。

4 結論

（1）單因素研究表明，土壤含水率為60%、搖床轉速為160r·min-1、Tween80 濃度為4CMC、土壤含油率為8%、藜蘆醇濃度為0.25g·L-1時白腐真菌對土壤中石油達到最大降解。

（2）響應面實驗表明，Tween80、含水率、含油率3 個因素對石油降解率的影響大小依次為：含油率＞含水率＞Tween80，含水率和含油率的交互作用對土壤中石油的降解率影響較顯著。響應面模型優(yōu)化后得到的最佳降解條件為土壤含水率58.2%、土壤含油率8.27%、Tween80 2.93CMC，此時土壤中石油的預期降解率能達到60.93%；驗證實驗得到的降解率為58.68%，達到理論預測值的97.73%。

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