吳智鴻，趙硯瑾，王永珍，姚鄭林，江發(fā)龍，匡先照，張養(yǎng)軍，李庶心

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850）

帕唑帕尼（pazopanib，Votrient）是英國葛蘭素史克（GSK）公司研發(fā)的一種口服VEGF-2 抑制劑，通過抑制VEGFR 自身的磷酸化，使VEGFR 酪氨酸激酶失活，阻斷VEGF 信號[1,2]在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制血管生成，達(dá)到“餓死”腫瘤的目的。已于2009年10月獲美國FDA 批準(zhǔn)上市，用于治療晚期腎細(xì)胞癌[3,4]。臨床試驗顯示其對腎細(xì)胞癌、肉瘤等多種腫瘤有抑制作用，口服生物利用度和藥代動力學(xué)性質(zhì)較好，不良反應(yīng)和毒副作用相對較少[5-7]。作為抗腫瘤藥物，帕唑帕尼有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）不易耐藥，血管內(nèi)皮細(xì)胞基因[8]相對穩(wěn)定；（2）抗瘤譜廣，所有腫瘤都要依賴于血管供給營養(yǎng)[9]；（3）副作用少，針對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]，正常組織血管不易受損；（4）易到達(dá)作用部位，藥物直接作用于新生血管壁。但其同時仍然存在多種不良反應(yīng)，最常見的包括腹瀉、惡心、嘔吐、疲勞、高血壓、頭發(fā)顏色改變和食欲減退。而蛋白尿、AST 升高、錐體外系失調(diào)、靜脈血栓、腫瘤出血等也很常見[11，12]，限制了臨床應(yīng)用。

本研究的目的是結(jié)合帕唑帕尼的構(gòu)效關(guān)系，在保持原有活性必須基團(tuán)的基礎(chǔ)上，對非活性必須基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，以儲備新結(jié)構(gòu)化合物并用于篩選低毒、高效且理化性質(zhì)更穩(wěn)定的抗腫瘤化合物。帕唑帕尼類化合物的構(gòu)效關(guān)系[13]為：（1）嘧啶環(huán)上的N1、C2可與VEGFR-2 催化位點(diǎn)的Cys919 的多肽骨架酰胺形成氫鍵相互作用，為活性必須。嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)間的氮原子甲基化對活性影響不大，只會改變口服生物利用度和藥代動力學(xué)性質(zhì)；（2）吲唑環(huán)除了改進(jìn)該類化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)（包括體內(nèi)清除率和生物利用度）外，芳香化的吲唑環(huán)的π 電子云與Lys868 的ε 氨基可產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用；3-甲基吲唑環(huán)上的N 對細(xì)胞色素P450 酶（CYP450）的血紅素鐵有很強(qiáng)的結(jié)合作用，導(dǎo)致對大量CYP450 同功酶有抑制性等副作用。為了降低該副作用，可在N 上引入一些取代基增加位阻；（3）苯磺酰胺基團(tuán)同樣是其活性必不可少的片段。

依據(jù)帕唑帕尼的構(gòu)效關(guān)系，本研究嘗試做出了如下修飾：在嘧啶環(huán)C5進(jìn)行氯取代；去掉嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)間的氮原子上的甲基；對換苯磺酰胺與吲唑環(huán)的位置；豐富吲唑環(huán)的結(jié)構(gòu)。并以3-硝基-6-甲基苯胺和3-硝基-6-乙基苯胺為原料，通過成環(huán)、氨基甲基化、硝基還原、親核取代反應(yīng)合成得到了3個目標(biāo)化合物（如圖1），并通過了1H NMR 和LC-MS 的確證，且均未見文獻(xiàn)報道。合成路線步驟少，產(chǎn)率高易純化，可為同類型化合物的合成提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JNM-ECA-400 超導(dǎo)核磁儀（400MHz日本電子株式會社）；API-150ex（ESI）型質(zhì)譜儀（美國AB 公司）。

3-硝基-6-甲基苯胺、3-硝基-6-乙基苯胺和2,4,5-三氯嘧啶，北京偶合有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純或分析純。

1.2 目標(biāo)化合物的合成路線

目標(biāo)化合物1～5 的合成路線見圖2。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.2 Synthetic route of the target compounds

1.3 中間體的合成

1.3.1 6-硝基-2H-吲唑（I1） 將1g 3-硝基-6-甲基苯胺（6.6mmol），加入到20mL HAc 中，再分批加入0.57g NaNO2（8.3mmol），常溫攪拌0.5h 后，TLC顯示反應(yīng)完全，減壓蒸干溶劑，用乙酸乙酯（30mL）溶解，再用飽和NaHCO3（20mL×3）洗滌，有機(jī)層用無水MgSO4干燥，抽濾，減壓濃縮，烘干后得橘黃色固體0.5g,產(chǎn)率為47.3%。

1.3.2 3-甲基-6-硝基-2H-吲唑（I2） 實驗方法同1.3.1 項下，主要原料投料量分別為1g 3-硝基-6-乙基苯胺（6.0mmol）,NaNO2（0.52g,7.57mmol）,得棕黃色固體0.47g,產(chǎn)率為44.3%。

1.3.3 1-甲基-6-硝基-1H-吲唑（I3） 在100mL三頸瓶中，加入20mL 重蒸DMF，再分批加入0.59g NaH（24.6mmol），冰浴條件下攪拌10min，將2g 6-硝基-2H-吲唑（12.3mmol）分批加入反應(yīng)瓶中，15min 后恢復(fù)室溫反應(yīng)，常溫攪拌0.5h 后，滴加CH3I 2.9g（20.4mmol），滴畢攪拌10min，TLC 顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入200mL 水中，有固體析出，過濾，濾液用乙酸乙酯萃?。?0mL×2），有機(jī)層用無水MgSO4干燥，抽濾，減壓濃縮，與濾餅一起烘干，通過干法過層析柱得固體0.95g。產(chǎn)率為43.8%。

1.3.4 2-甲基-6-硝基-2H-吲唑（I4） 實驗方法同1.3.3 項下，主要原料投料量分別為NaH（0.59g,24.6mmol）,6-硝基-2H-吲唑（2g,12.3mmol），CH3I 2.9g（20.4mmol），得1.15g 固體，產(chǎn)率為52.8%。

1.3.5 1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（I5） 實驗方法同1.3.3 項下，主要原料投料量分別為NaH（0.27g,11.3mmol）,3-甲基-6-硝基-2H-吲唑（1g,5.6 mmol）,CH3I（2.4g,16.9mmol）,得固體0.68g，產(chǎn)率為63.5%。

1.3.6 1-甲基-6-胺基-1H-吲唑（I6） 在100mL三頸瓶中，加入1-甲基-6-硝基-1H-吲唑1g（5.6 mmol），F(xiàn)e 粉2.5g（44.6mmol），NH4Cl 1.2g（22.4mmol），乙醇/ 水（4∶1）20mL，攪拌條件下慢慢升溫至80℃，0.5h 后，TLC 顯示反應(yīng)完全，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，乙酸乙酯（30mL）溶解，再用清水（20mL×3）洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，抽濾，減壓濃縮，烘干后得土黃色固體0.75g，產(chǎn)率為90.3%。

1.3.7 2-甲基-6-胺基-2H-吲唑（I7） 實驗方法同1.3.6 項下，主要原料投料量分別為2-甲基-6-硝基-2H-吲唑（3g,16.9mmol），F(xiàn)e 粉（7.6g,135.7 mmol），NH4Cl（2.7g,50.4mmol），得土黃色固體1.5g，產(chǎn)率為60%。

1.3.8 1，3-二甲基-6-胺基-1H-吲唑（I8） 實驗方法同1.3.6 項下，主要原料投料量分別為1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（4g,20.9mmol），F(xiàn)e 粉（9.4g,167.9mmol），NH4Cl（3.4g,63.5mmol），得固體2.6g，產(chǎn)率為76.7%。

1.3.9 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1-甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（I9） 將1g1-甲基-6-胺基-1H-吲唑（6.8mmol），0.3g NaHCO3（3.6mmol）溶于20mL 乙醇及5mLTHF 中，加入2,4,5-三氯嘧啶3.7g（20.2mmol）,升溫至75℃，反應(yīng)4h 后，有固體析出，TLC 顯示反應(yīng)完全，過濾濾餅用乙醇（10mL×2）洗滌，烘干得黃白色固體0.67g，產(chǎn)率為33.5%。

1.3.10 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（2-甲基-2H-吲哚-6-基）-胺（I10） 實驗方法同1.3.9 項下，主要原料投料量分別為2-甲基-6-胺基-2H-吲唑（1.5g,10.2mmol），NaHCO3（0.43g，5.1mmol）,2,4,5-三氯嘧啶（5.6g,30.6mmol）,得灰白色固體1g，產(chǎn)率為34.0%。

1.3.11 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1，3-二甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（I11） 實驗方法同1.3.9 項下，主要原料投料量分別為1，3-二甲基-6-胺基-1H-吲唑（1g,6.2mmol），NaHCO3（0.26g，3.1mmol）,2,4,5-三氯嘧啶（3.4g,18.6mmol）,得灰白色固體0.62g，產(chǎn)率為32.5%。

1.4 目標(biāo)化合物的合成

1.4.1 目標(biāo)化合物1 將0.4g（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1-甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（0.9mmol）與0.25g5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（1.3mmol）溶于20mL 異丙醇中，加入1mL 濃HCl，升溫至回流14h 后，TLC 顯示反應(yīng)完全，過濾，濾餅用乙醇（5mL×3）洗滌，烘干得白色固體0.32g，產(chǎn)率為60.0%。

1.4.2 目標(biāo)化合物2 實驗方法同1.4.1 項下，主要原料投料量分別為（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（2-甲基-2H-吲哚-6-基）-胺（0.4g,1.36mmol），5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（0.25g，1.3mmol），得白色固體0.29g，產(chǎn)率為50.3%。

1.4.3 目標(biāo)化合物3 將（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1，3-二甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（0.4g,1.3mmol）與5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（0.25g，1.3mmol）溶于20mL 仲丁醇中，加入1mL CF3COOH，升溫至回流40h 后，TLC 顯示反應(yīng)完全，過濾，濾餅用乙醇（5mL×3）洗滌，烘干得白色固體0.25g，產(chǎn)率為42.0%。

1.5 化合物的體外活性初步評價實驗

1.5.1 實驗原理 MTT 分析法是以活細(xì)胞代謝物還原劑噻唑藍(lán)（MTT）為基礎(chǔ)的分析方法。噻唑藍(lán)可作用于活細(xì)胞的線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C 的作用下四唑環(huán)開裂，生成藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶，甲瓚結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞的數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將噻唑藍(lán)還原）。甲瓚結(jié)晶可被二甲基亞砜（DMSO）溶解，利用酶標(biāo)儀測定570nm 處的光密度（OD）值，可以反映出活細(xì)胞的數(shù)目。

1.5.2 實驗方法 取培養(yǎng)4～5d，并處于對數(shù)生長期的胃細(xì)胞癌MGC803 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液計數(shù)。用完全培養(yǎng)基RPMI1640 稀釋細(xì)胞懸液至所需的細(xì)胞濃度。取96 孔平板，每孔加細(xì)胞懸液180μL，接種細(xì)胞3000/孔,加細(xì)胞過程控制在4h,于37℃、5%CO2溫箱孵育24h。受試化合物分別溶解并依次稀釋成5 個濃度（10-5，5×10-6，10-6，10-7和10-8mol·L-1），每孔加入20μL，在37℃、5%CO2及100%濕度，孵育4～5d。噻唑藍(lán)用生理鹽水配成5mg·mL-1溶液，每孔加20μL，37℃溫育4h，使噻唑藍(lán)還原為甲臜。吸出上清液，加入200μL 的二甲基亞砜（DMSO）使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。用自動化分光光度平板讀數(shù)計（Model 312,Biotech Research Laboratories,Inc.,Rockville,Md）在570nm 處檢測每個小孔的光密度。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

目標(biāo)化合物1: 白色固體，ESI-MS m/z：444.1[M+H]+,分子式為C19H18ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：2.51（s,3H）,3.94（s,3H）,6.93-6.95（d,1H）,7.32-7.39（m,3H）,7.74-7.76（d,1H）,7.79-7.82（dd,1H）,7.93（s,2H）,8.032-8.034（d,1H）,8.30（s,1H）,9.51（s,1H）,10.10（s,1H）.

目標(biāo)化合物2: 白色固體，ESI-MS m/z：444.1[M+H]+,分子式為C19H18ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：2.51（s,3H）,4.17（s,3H）,7.02-7.04（d,1H）,7.24-7.26（dd,1H）,7.39（s,2H）,7.69-7.71（d,1H）,7.78-7.81（dd,1H）,7.89-7.92（d,2H）,8.29（s,1H）,8.35（s,1H）,9.52（s,1H）,10.16（s,1H）.

目標(biāo)化合物3: 白色固體，ESI-MS m/z：458.1[M+H]+,分子式為C20H20ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：3.85（s,3H）,4.72-4.77（t,6H）,6.98-7.00（d,1H）,7.29-7.33 （m,3H）,7.66-7.68（d,1H）,7.82-7.88（m,3H）,8.23（s,1H）,9.27（s,1H）,9.82（s,1H）.

2.2 化合物的初步活性評價

初步計算的結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物1～3 對MGC803 細(xì)胞的IC50分別為（0.868±0.096）、（88.805±10.819）、（4.322±1.790）μmol·L-1，陽性對照帕唑帕尼的IC50為（4.436±0.757）μmol·L-1。表明化合物1、3 的活性超過或接近陽性對照物帕唑帕尼，表明它們具有較高的抗腫瘤活性，其中1 的生物活性為帕唑帕尼的5 倍，可選為先導(dǎo)化合物作進(jìn)一步研究，為找尋新的具有更高活性的先導(dǎo)化合物提供了可能。

3 討論

有文獻(xiàn)[5]報道在制備2,3-二甲基-6-硝基-2H-吲唑的過程中，需要用到的原料是三甲基氧鎓四氟硼酸鹽或是硫酸二甲酯，但是前者價格昂貴，后者污染嚴(yán)重。本文參考此法，改進(jìn)反應(yīng)條件，成功地以氫化鈉和碘甲烷為原料，合成出了1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（I5）。雖然產(chǎn)率由70%略微降到了63.5%，但實驗更經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

目標(biāo)化合物的體外活性測試表明：（1）1H-吲唑環(huán)相比2H-吲唑環(huán)有更高的活性，兩個活性較好的化合物均為1H-吲唑結(jié)構(gòu)。（2）在嘧啶環(huán)C-5 位引入鹵素如：氯，有利于增強(qiáng)本類化合物對靶酶的抑制活性。（3）對比目標(biāo)化合物1、3，表明在吲唑環(huán)上即使有相同的取代基，但其余的取代基不同，也會導(dǎo)致化合物的活性有一定的差別。

本文以葛蘭素史克公司研發(fā)的多靶點(diǎn)VEGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑帕唑帕尼為先導(dǎo)化合物，尋找合理的構(gòu)建單元，設(shè)計合成了3 個帕唑帕尼衍生物。其中1、3 具有較高的抗腫瘤活性，為找尋低毒、高效、穩(wěn)定的抗腫瘤藥物提供了可能。

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