馬茹霞，晏磊，王國興，王長虹，賈軍，鄧兵，沈婷婷，王偉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.上海巖土工程勘察設(shè)計研究院有限公司）

硝化作用在地球的氮素循環(huán)過程中起重要的作用，其主要包括兩個步驟，第一步通過氨氧化菌將氨氧化為亞硝酸鹽，第二步通過亞硝酸鹽氧化菌將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。其中，氨氧化細(xì)菌（Ammoniaoxidizing bacteria，AOB）介導(dǎo)的氨氧化作用是其限速步驟，主要由屬于變形桿菌門的β-亞綱和γ-亞綱的氨氧化菌來完成[1]。AOB進(jìn)行的氨氧化作用是由氨單加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO）催化的，編碼AMO的基因（amo A，amo B和amo C）分別編碼其3個亞基[2]。1997年，Rotthauwe首次使用amo A-PCR方法研究了自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[3]，此后，amo A基因被廣泛運(yùn)用于各種生態(tài)系統(tǒng)中自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)研究[3]。有研究發(fā)現(xiàn) Nitrosomonas sp.和Nitrosospira sp.為一些堆肥過程中的關(guān)鍵AOB菌群[4]，由于Nitrosospira sp.生長速度較慢，目前在活性污泥中很少檢測到[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在海洋和陸地環(huán)境的一些嗜溫和嗜熱古菌中也含有amo A基因的同系物，并且能催化氨氧化反應(yīng)[6-7]，這一發(fā)現(xiàn)將參與氮素循環(huán)的微生物擴(kuò)展到了古菌領(lǐng)域。進(jìn)一步研究表明，海洋中AOA的數(shù)量占了整個微生物數(shù)量的39%，這些AOA很有可能在海洋環(huán)境的硝化作用中起著重要的作用[8-9]。近期，第一株 AOA-Nitrosopumilu smaritimus的成功培養(yǎng)以及古菌amo A基因的mRNA對氨鹽添加的響應(yīng)[6]，強(qiáng)有力地證實了AOA在自然界中的真實存在。到目前為止，富集培養(yǎng)AOA已有4種Nitrosopumilu smaritimus[6]、Cenarchaeumsymbiosum[10]、Nitrososphaera gargensis[11]和 Nitrosocaldus yellowstonii[7]。最近，大量的研究發(fā)現(xiàn)屬于泉古菌門的AOA也能氧化氨，廣泛分布于土壤、河口沉積物、牛糞堆肥及污水處理廠等環(huán)境中[12]，自然界中AOA的多樣性和功能研究迅速成為新的研究熱點。

龍鳳濕地位于黑龍江省大慶市，是全國最大的城市濕地，常年淹水，水來源于自然降水、嫩江引水和城市污水廠凈化后的水，是典型的受人工干擾的濕地類型[13]。濕地生態(tài)系統(tǒng)對氨態(tài)氮有顯著的截留和凈化功能，而氨態(tài)氮是AOB和AOA進(jìn)行氨氧化反應(yīng)的底物，氮循環(huán)是濕地生態(tài)系統(tǒng)中最基本和重要的物質(zhì)循環(huán)之一。實驗分別以AOB和AOA的amo A功能基因為目標(biāo)，構(gòu)建其amo A基因克隆文庫，研究龍鳳濕地底泥中AOB和AOA的多樣性，并對其底泥理化參數(shù)進(jìn)行分析，以期為人工干擾型濕地氨氧化微生物研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采集于黑龍江省大慶市龍鳳濕地的底泥（2013年10月31日），采用多點取樣法，垂直取水下10～25 cm深的底泥，每個點取樣量相同，混合均勻后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中迅速帶回實驗室，其中一部分樣品用于理化參數(shù)的測定，另一部分存置于-20℃冰箱凍存用于后續(xù)DNA的提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 底泥理化參數(shù)的測定

底泥中鹽分采用重量法測定，銨態(tài)氮采用靛酚藍(lán)比色法測定，硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法測定，亞硝態(tài)氮采用重氮化偶合分光光度法測定，全氮采用開氏消煮法測定，全磷采用酸溶-抗比色法測定，全鉀采用氫氟酸-高氯酸消煮-火焰光度法測定，上述測定方法見參考文獻(xiàn)[14]。pH利用數(shù)字pH計（日本）測定。

1.2.2 樣品總DNA的提取

取0.1 g底泥樣品，利用改進(jìn)的氯化芐法提取總DNA[15]，重復(fù)3次。為除去腐殖酸等雜質(zhì)，將提取的DNA混合，純化試劑盒純化粗提的總DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 AOB amo A基因的PCR擴(kuò)增

利用引物amo A-1F（5′-GGGGTTTCTACTGGTG GT-3′）和amo A-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCT T-C-3′）對AOB amo A基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為25μL體系：2.5μL 10×buffer，0.5μL 10 mM dNTP，0.5μL模板 DNA，1μL Taq DNA聚合酶（5 U），引物各0.25μL，加ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃最后延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.4 AOA amo A基因的PCR擴(kuò)增

利用引物Arch-amo AF（5′-STAATGGTCTGGCT TAGACG-3′）和Arch-amo AR（5′-GCGGCCATCCAT CTGTATGT-3′）對AOA amo A基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為 25μL體系：2.5μL 10×buffer，0.5μL 10 mM dNTP，0.5μL模板DNA，1μL Taq DNA聚合酶（5 U），引物各 0.25μL，加ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃最后延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的純化與連接

每次PCR重復(fù)3次且設(shè)置陰性對照，PCR均停止于4℃，產(chǎn)物采用純化試劑盒回收。

PCR連接反應(yīng)體系為：PGEM-T Easy載體1μL，10×T4 DNA Ligation Buffer 5μL，PCR回收產(chǎn)物3μL，T4 DNA Ligase 1μL。輕彈離心管使混合均勻，16℃連接過夜。

早在1910年與1937年HARTMANN和JAUDON就提出低血糖是新生兒常見疾病，會造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷與危害[1],其危險因素與低體溫、早產(chǎn)兒、低出生體質(zhì)量兒、喂養(yǎng)不當(dāng)、孕母糖尿病等有關(guān)[2]。研究亦報道新生兒低血糖癥發(fā)病越早、程度越重、存在時間越長，越易造成新生兒智力低下、腦癱等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的永久性損害[3]。因此,掌握新生兒血糖檢測值在臨床工作中尤為重要，對高危兒的血糖干預(yù)逐漸成為常規(guī)。而照顧新生兒的醫(yī)護(hù)人員對于影響血糖值相關(guān)因素的認(rèn)知，更與臨床提供安全有效的高質(zhì)量護(hù)理密切相關(guān)。

1.2.6 amo A基因克隆文庫的構(gòu)建

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞100μL，置于冰浴中，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮，加入5μL連接液，輕輕搖勻，冰上放置30 min；42℃水浴熱激70 s，冰上放置 2 min，加 LB培養(yǎng)基 400μL，200～250 rpm，37℃震蕩培養(yǎng)1 h，室溫下4 000 rpm離心5 min，棄去400μL上清液，用剩余的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞涂布在預(yù)先用100μL 20mg·mL-1X-gal和20μL 100 mM·L-1IPTG涂布的含有氨芐青霉素LB固體平板上。平板正向放置40min后倒置培養(yǎng)過夜。選擇在IPTG-Xgal平板上生長的白色斑點，分別用無菌tip頭挑取各轉(zhuǎn)化子至含氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜。通過藍(lán)白斑選擇陽性克隆子，分別得到AOB與AOA的amo A基因克隆文庫。

1.2.7 克隆文庫的限制性長度多態(tài)性分析

利用引物M13-47（5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′）和RV-M（5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3′）對克隆文庫的插入片段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2.5μL 10× Reaction Buffer，0.5μL 10 mM dNTP，2μL 25 mM MgCl2，引物M13-47和RV-M各0.25μL，菌少許，Taq DNA聚合酶（5 U）0.25μL，補(bǔ)充ddH2O至25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃預(yù)變性30 s；62℃變性30 s；72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃最后延伸10min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，2.0μg·mL-1EB染色10min后檢測。

采用限制性內(nèi)切酶MspⅠ和HinfⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分型。酶切反應(yīng)體系為：MspⅠ0.3μL，HinfⅠ0.3μL，10×M Buffer 1μL，DNA 3μL，ddH2O 5.4μL。37℃恒溫水浴10min，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RFLP帶型。

1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過分析RFLP帶型圖譜，選擇克隆子進(jìn)行測序。文庫中將序列之間的相似性≥97%的序列作為一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），基因序列Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），利用MEGA4.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

2 結(jié)果和分析

2.1 龍鳳濕地底泥理化參數(shù)分析

表1為大慶龍鳳濕地底泥的理化參數(shù)，其pH達(dá)到9.1，呈弱堿性，且其鹽分含量達(dá)到1.0%，說明大慶龍鳳濕地有鹽堿化。全氮的含量為2.61 mg·kg-1（以干樣計，下同）。氨態(tài)氮與硝態(tài)氮的含量分別為3.86 mg·kg-1和16.87mg·kg-1，說明此濕地底泥為低氮環(huán)境。

表1 濕地底泥的理化參數(shù)Table 1 The physicochemical parameters ofwetland sediment

2.2 濕地底泥AOB的多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)各時期的OTU數(shù)與克隆子數(shù)繪制的AOB rarefaction曲線如圖1。可以看出，AOB的rarefaction曲線趨于平穩(wěn)，這說明所選取的克隆均具有很好的代表性，可以代表文庫中大多數(shù)AOB的類型。

表2 濕地底泥AOB amo A基因序列統(tǒng)計結(jié)果Table 2 The statistical results of gene sequences on AOB amo A ofwetland sediment

基于濕地底泥中氨氧化細(xì)菌amo A基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。所有的序列均屬于Nirtosonomonas，與海洋亞硝化球菌（Nitrosococcus oceani）聚于進(jìn)化樹的不同分支。其中，LF-AOB-1在所有的克隆子中所占的比例為47.15%，與Liu等在河水泥沙中獲得的序列（KF803085）相似率為99%。LF-AOB-2和LF-AOB-3分別與來自污水處理廠（JQ277647）和濕地沉積物（HQ202453）的序列聚在進(jìn)化樹的同一分支。

圖1 濕地底泥中AOB克隆文庫的rarefaction曲線Fig.1 Curve of AOB clone library ofwetland sediment rarefaction

圖2 濕地底泥中AOA克隆文庫的rarefaction曲線Fig.2 Curve of AOA clone library ofwetland sediment rarefaction

圖3 基于amo A基因構(gòu)建的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Thephylogenetic treeofAOBbased on amo Agenesequences

2.3 濕地底泥AOA的多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Arch-amo AF和Arch-amo AR對龍鳳濕地底泥AOA的amo A基因擴(kuò)增，得到大小約600 bp的條帶。構(gòu)建的amo A基因克隆文庫經(jīng)雙酶切測序后得到3個OTU類型（97%相似率）（表3）。所有的序列與來自與河口沉積物等環(huán)境中的AOA amo A基因就有較高的相似性。

根據(jù)各時期的OTU數(shù)與克隆子數(shù)繪制的AOA rarefaction曲線如圖2?？梢钥闯觯珹OA的rarefaction曲線基本趨于平穩(wěn)，這說明所選取的克隆均具有很好的代表性，可以代表文庫中大多數(shù)AOA的類型。

表3 濕地底泥AOA amo A基因序列統(tǒng)計結(jié)果Table 3 The statistical results of gene sequences on AOA amo A ofwetland sediment

從AOA的amo A基因系統(tǒng)發(fā)育樹來看（圖4），所有的序列均屬于不可培養(yǎng)的泉古菌門（Crenarchaeota）。其中，LF-AOA-1和LF-AOA-3分別與來自土壤和淡水濕地的序列聚在進(jìn)化樹的同一分支，其克隆子在文庫中分別占11.6%和0.47%。LFAOA-2在所有的克隆子中所占的比例最高（83.7%），為底泥中AOA的優(yōu)勢菌屬。

3 討論

從AOB amo A基因克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育看到，本試驗只檢測到Nitromonas，并沒有發(fā)現(xiàn)Nitrosospia，菌種類型較少，其與來自江河口沉積物和污水處理廠的序列均有較高的相似率。研究證明，在污水處理廠、人工濕地等pH較高的環(huán)境中通常能夠檢測到Nitrosomonas[17]。賀紀(jì)正等在封丘長期定點試驗的堿性環(huán)境研究中也沒有發(fā)現(xiàn)Nitrosospira的存在[18]，推測Nitrosospira偏愛于pH值較低的環(huán)境條件中生存，這與研究的結(jié)果相似。

研究發(fā)現(xiàn)AOA普遍存在于土壤[12]、河口沉積物、海水沉積物、陸地?zé)崛诘茸匀画h(huán)境中，這些研究結(jié)果預(yù)示著AOA在自然環(huán)境中的氮素循環(huán)中具有重要作用。本研究在龍鳳濕地底泥中，同樣證實AOA的存在，所獲得的AOA amo A基因序列均屬于泉古菌門（Crenarcharota）。有研究認(rèn)為，與AOB相比，AOA更適合低濃度銨氮的環(huán)境條件，并且在此條件下的硝化作用中起主導(dǎo)作用[19]。Hatzenpichler等[11]認(rèn)為AOA的生長能夠受到高濃度銨的抑制。研究中的濕地底泥銨態(tài)氮濃度較低，有利于AOA的生長。AOA的發(fā)現(xiàn)改變了人們對傳統(tǒng)氮素循環(huán)中氨氧化過程完全由AOB驅(qū)動的認(rèn)識，而AOA與AOB對濕地底泥中氨氧化作用的相對貢獻(xiàn)率還需要進(jìn)一步深入研究。

圖4 基于amo A基因構(gòu)建的AOA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of AOA based on amo A gene sequences

4 結(jié)論

（1）龍鳳濕地底泥中得到3個AOB的OTU類型，所有的AOB的amo A基因序列均屬于Nitromonas，未發(fā)現(xiàn)Nitrosospia的存在，這可能與此濕地底泥中較高的pH環(huán)境條件有關(guān)。

（2）龍鳳濕地底泥中得到3個AOA的OTU類型，所有的AOA的amo A基因序列均屬于Crenarcharota，與來自河口沉積物等環(huán)境中的序列具有較高的相似性，預(yù)示著AOA在人工干擾類型濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)過程中可能起重要的作用。

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