龔文平，溫博海

斑點熱是由立克次體屬（Rickettsia）的斑點熱群立克次體（spotted fever group Rickettsiae,SFGR）引起的一類以急性發(fā)熱和全身皮疹為主要特征的疾病總稱。SFGR是一類全球性分布、嚴格血管內皮細胞寄生的革蘭陰性小桿菌，是立克次體目中最大和最復雜的一群，到目前為止已經發(fā)現(xiàn)19種能引起人感染的SFGR（表1）。其中立氏立克次體（Rickettsia rickettsii）在立克次體中毒性最強，其所致的落基山斑點熱（Rocky Mountain spotted fever,RMSF）在無抗生素時代病死率高達60%～80%，即便在抗生素治療（立克次體對四環(huán)素類抗生素敏感）的情況下病死率仍為5%～10%[1-2]。因此，立氏立克次體被聯(lián)合國列入生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑清單[3]。

斑點熱主要通過蜱叮咬傳播，潛伏期2～14 d。不同SFGR引起的感染有不同的病名，但臨床癥狀大致相同，主要表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、疲倦和肌肉酸痛，伴隨著由四肢向軀干方向發(fā)展的皮疹[4]。立克次體感染引起內皮細胞損傷，引發(fā)局部和全身血管損傷，隨著病情發(fā)展，患者可因低血壓休克、急性腎衰竭、肺水腫和腦膜炎等嚴重并發(fā)癥而死亡[5]。

斑點熱早期缺乏特異性臨床癥狀，難以確診，患者往往因被誤診不能得到及時治療而死亡。預防斑點熱，尤其是立氏立克次體自然感染或人為攻擊，迫切需要安全、有效、不良反應少的疫苗[3]。本文就疫苗的研究進展及未來發(fā)展方向進行綜述。

1 滅活疫苗

和大多數(shù)疫苗的發(fā)展歷程相同，斑點熱疫苗研究的起點是滅活疫苗，根據技術和方法的不同又分為3個階段。1925年，Spencer和Parker首先進行滅活立氏立克次體的RMSF疫苗研究[3]。他們首先將處于饑餓狀態(tài)的蜱放在立氏立克次體感染的豚鼠身上吸血，使立克次體在蜱體內大量繁殖，隨后將繁殖的立克次體從蜱體粗分離，再用酚和甲醛滅活立克次體制備滅活疫苗。遺憾的是，追蹤研究15年后發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗免疫僅能減輕立氏立克次體感染的臨床癥狀，對降低病死率并不顯著[6]。1938年，Herald首次將立氏立克次體在雞胚卵黃囊中大量繁殖成功，從雞胚卵黃囊膜中提取立氏立克次體，然后用苯酚和福爾馬林將提取的立克次體滅活后制備疫苗[3]。但是，后來的研究證明用雞胚繁殖立氏立克次體滅活疫苗免疫保護效果也不理想[3]。

表1 SFGR概況一覽表[4]Table 1 Known human spotted fever group rickettsial pathogens[4]

接踵而來的失敗使斑點熱疫苗的研究履步維艱，直到1975年來自美國陸軍傳染病研究所的Kenyon和Pedersen[7]報道成功地利用雞胚成纖維細胞培養(yǎng)出純度很高的立氏立克次體，這一成果為RMSF疫苗的研發(fā)注射了一劑強心針。1983年采用滅活雞胚細胞培養(yǎng)立氏立克次體對疫區(qū)志愿者進行免疫接種[3]，結果顯示該滅活疫苗可保護四分之一的志愿者，能明顯減輕發(fā)熱等臨床癥狀，增強四環(huán)素的治療效果。盡管該細胞培養(yǎng)立氏立克次體滅活疫苗的保護效果仍不夠理想，但是這一研究成果為大量培養(yǎng)立克次體奠定了基礎，給RMSF疫苗的研發(fā)帶來新的希望。

2 減毒活疫苗

與滅活疫苗比較，減毒活疫苗具有用量少、免疫持久、不良反應少等優(yōu)點，但是由于減毒活疫苗有可能在體內突變而出現(xiàn)毒力增強的危險，烈性傳染病減毒活疫苗的研究應非常謹慎。SFGR的致病能力千差萬別，即便是同一種立克次體，不同菌株的致病能力也可明顯不同，同一株立克次體對人和動物的病理損傷也不盡相同[8]。雖然減毒貝氏柯克斯體做Q熱疫苗[9]以及普氏立克次體弱毒株（E株）做流行性斑疹傷寒疫苗[10]已有報道，但斑點熱減毒活疫苗的研究還未見報道。

3 亞單位疫苗

隨著20世紀70年代后蛋白質和基因分析等生物學技術的快速發(fā)展，以及免疫保護效能評價方法的改善，使得許多立克次體保護性抗原得到識別。斑點熱疫苗的研究熱點從滅活疫苗轉向亞單位疫苗。特別是最近德克薩斯大學醫(yī)學部學者采用反向疫苗學體外篩選和體內篩選相結合法鑒定出能被CD8+T淋巴細胞識別的4個普氏立克次體保護性抗原[11]，它們除能誘導小鼠產生抗普氏立克次體引起的流行性斑疹傷寒外，還能誘導交叉保護對抗莫氏立克次體引起的地方性斑疹傷寒，為篩選抗立克次體保護性抗原及研發(fā)亞單位疫苗提供新的有效途徑。

3.1 外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白B（OmpB）

1944年Topping和Shear[12]從乙醚處理后的立氏立克次體中發(fā)現(xiàn)了群特異的“可溶性”補體結合抗原。2年后，Shepard和Wyckoff[13]通過電鏡技術證明“可溶性”抗原來自立克次體細胞膜。1974年，美國疾病預防控制中心利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）技術對乙醚處理后的立氏立克次體進行研究，發(fā)現(xiàn)“可溶性”抗原包含9個分子量為28～150 kDa的蛋白，立氏立克次體至少含有30多種分子量為23～155 kDa的蛋白，其中分子量為 120 kDa（OmpB）和 155 kDa（OmpA）的 2 個蛋白為高豐度膜蛋白[14]，以后的研究證明其在立克次體粘附和入侵宿主細胞等致病性方面發(fā)揮著重要的作用[15]。此外，OmpA已被證實可用作SFGR基因型和亞型之間的鑒別[16]。

1985年有研究用立氏立克次體單克隆抗體被動免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)僅僅針對170 kDa（OmpA）和133 kDa（OmpB）2個大分子的單克隆抗體具有特異性免疫保護效能[17]。之后用立氏立克次體重組OmpB免疫豚鼠，攻毒后顯示免疫豚鼠能有效抵抗立氏立克次體的攻擊[18]。Feng等[19]用立氏立克次體重組OmpA和OmpB分別免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)這2種免疫血清均能中和立氏立克次體毒性，用立氏立克次體或康氏立克次體OmpA或OmpB單克隆抗體被動免疫小鼠能夠提供小鼠對抗同源立克次體攻擊的有效保護。在立克次體感染過程中，F(xiàn)c受體介導的免疫效應功能[19]和抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用[20]與巨噬細胞的吞噬調理有關[21]。研究證明Fc依賴的特異性抗體可誘導宿主細胞產生調理素[22]、一氧化氮和過氧化氫來抑制立克次體感染內皮細胞和吞噬細胞[23]。

許多研究發(fā)現(xiàn)OmpA和OmpB特異性抗體在抑制SFGR粘附和入侵宿主細胞過程中起著重要作用，但是大量研究也證實清除寄生于胞內的立克次體主要依賴特異性細胞免疫反應。用立氏立克次體OmpA的DNA片段做疫苗，結果免疫小鼠能抵抗親緣關系較遠的康氏立克次體的攻擊；同時發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗能刺激T淋巴細胞產生高水平的干擾素（interferon,IFN）γ，提示OmpA特異的細胞免疫提供了交叉保護[24]。此外，用康氏立克次體感染小鼠，發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細胞尤其是細胞毒性T淋巴細胞在清除小鼠體內立克次體時甚至比CD4+T淋巴細胞更重要[25]。隨后發(fā)現(xiàn)高水平的OmpA和OmpB特異性抗體出現(xiàn)在立克次體感染恢復期[19]，提示出現(xiàn)較晚的特異性抗體主要在對抗立克次體再次感染時起重要作用，而對抗原發(fā)性立克次體感染主要依賴特異性細胞免疫。

3.2 Adr1、Adr2和YbgF 隨著蛋白質組學和基因組學的蓬勃發(fā)展，21世紀伊始已有幾種新的細胞表面蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2006年，法國學者率先通過蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)了立克次體粘附素Adr1和Adr2，證明二者在立克次體粘附與入侵中扮演著重要的角色，拓展了斑點熱亞單位疫苗的研究領域[26]。2011年，該團隊進一步研究發(fā)現(xiàn)普氏立克次體外膜蛋白Adr2在立克次體粘附和入侵宿主細胞過程中起關鍵作用[27]。

近年來，我國溫博海團隊通過細胞表面蛋白質技術成功鑒定出黑龍江立克次體表面蛋白YbgF以及立氏立克次體表面蛋白Adr1、Adr2和YbgF，并用透射免疫電鏡技術首次對其進行了亞細胞定位[15，28]。將這些表面蛋白分別免疫小鼠，用定量PCR分析其肝、脾、肺等立克次體感染靶器官的立克次體載量，結果顯示rYbgF和rAdr2蛋白可提供小鼠特異性免疫保護，有效抵抗致死量黑龍江立克次體或立氏立克次體的感染。最近，該團隊證明重組立氏立克次體蛋白抗原rAdr2和rOmpB的聯(lián)合免疫保護效能顯著好于rAdr2和rOmpB單抗原免疫[29]。隨后他們研究了這些立氏立克次體保護性抗原的免疫保護機制，發(fā)現(xiàn)抗原特異的CD4+和CD8+T淋巴細胞經立氏立克次體保護性抗原刺激后能產生高水平的IFNγ和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α，提示這些保護性抗原均能刺激抗原特異性CD4+Th1淋巴細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞迅速產生和分泌大量IFNγ和TNF-α，提示特異性細胞免疫應答在該抗原誘導的特異性免疫保護中起關鍵作用[29-31]。

4 DNA疫苗

隨著如火如荼的亞單位疫苗研發(fā)，立克次體DNA疫苗的研究開始初現(xiàn)端倪。2001年研究報道選取立氏立克次體OmpA的1個片段構建重組結核分枝桿菌疫苗和重組DNA疫苗，用其免疫小鼠，結果發(fā)現(xiàn)二者抗康氏立克次體感染保護率分別為67%和55%，當DNA疫苗免疫后再用蛋白疫苗加強免疫時保護率上升至75%[24]。2003年美國馬里蘭州大學用普氏立克次體入侵相關基因invA、細胞分裂相關基因fts、蛋白分泌相關基因sec、毒力相關基因 ompA、ompB、virB、cap、tlyA 及 tlyC 成功構建重組DNA質粒[32]，但是這些DNA質粒的免疫保護效能未見評價。2007年美國學者完成了立氏立克次體強毒株“Sheila Smith”全基因組的測序，次年完成了弱毒株“Iowa”全基因組測序[33]，比較二者的全基因組序列將為研發(fā)RMSFDNA疫苗和其他分子疫苗奠定重要基礎。

5 表位肽疫苗

盡管OmpA、OmpB、Adr2和YbgF等細胞表面蛋白先后被發(fā)現(xiàn)并證明是免疫保護性抗原，但其誘導機體產生的免疫應答不能持久，如要獲得較為持久的特異性免疫應答勢必要加大免疫劑量和次數(shù)，隨之增加的不良反應和有限的保護效能成為亞單位疫苗發(fā)展的瓶頸。

隨著免疫學和生物信息學技術的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)免疫細胞通常僅識別抗原分子上的一個特定氨基酸序列即表位（epitope），又稱為抗原決定簇。表位又可分為T淋巴細胞表位和B淋巴細胞表位，分別誘導機體產生細胞免疫應答和體液免疫應答。抗原表位的鑒定對研發(fā)表位肽疫苗具有重要意義[34]。

雖然針對立克次體的表位肽疫苗近幾年才走進人們的視野，但是相關研究卻要追溯到1991年，美國沃爾特里德陸軍研究所團隊利用SDS-PAGE分析恙蟲病立克次體表面抗原時，找到了一系列大小為18～35 kDa的蛋白，其中1個22 kDa的蛋白引起了他們的注意[35]。通過計算機分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了潛在的B淋巴細胞和T淋巴細胞表位。此后數(shù)十年，由于亞單位疫苗的興起使得處于萌芽狀態(tài)的表位肽疫苗研究被束之高閣。直到2003年重啟表位肽疫苗的研究，從康氏立克次體OmpB蛋白中篩選出5條能夠刺激CD8+T淋巴細胞分泌IFNγ的表位肽，進一步研究發(fā)現(xiàn)其中3條不僅能刺激CD8+T淋巴細胞增殖并分泌IFNγ，而且還可促進特異性細胞毒性T淋巴細胞的殺傷作用[36]。2006年，英國愛丁堡大學在研究立克次體進化時指出，OmpA和OmpB蛋白在歷經自然選擇后，立克次體的許多至關重要的氨基酸序列比較集中地出現(xiàn)在某幾個區(qū)域，而這些區(qū)域很可能就是表位肽的隱身之處[37]。

6 展 望

從滅活疫苗到表位肽疫苗，斑點熱疫苗的研究已走過了100多年的歷程。滅活疫苗作為斑點熱疫苗研究的鼻祖有著重要的意義，但由于其制備難度高、不良反應大、保護率低等不得不存封在歷史的記憶中。亞單位疫苗雖然彌補了滅活疫苗的很多不足，但是其免疫保護效果仍與人們的目標相差甚遠。最新研究證明多保護性抗原組合或T和B淋巴細胞表位肽組合能夠誘導機體產生更全面的免疫應答和更強的特異性抵抗，同時具有安全、可靠、生產方便的特點，為斑點熱分子疫苗的研發(fā)展現(xiàn)了美好前景。

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