鄧?guó)P春 于占江 楊鈺 趙紅曄 王濱 周麗

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，黑龍江齊齊哈爾161001;3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響

鄧?guó)P春1于占江2楊鈺2趙紅曄3王濱3周麗3

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，黑龍江齊齊哈爾161001;3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的通過測(cè)定隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的影響，探討其抗腫瘤的作用機(jī)制。方法采用四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，采用Real Time RT-PCR檢測(cè)隱丹參酮對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞6～48 h，其生長(zhǎng)和增殖均受到一定程度的抑制;24 h為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間，IC50為59.11 μmol/L;選取40、60和80 μmol/L 3個(gè)劑量作用于人胃癌細(xì)胞SGC7901 24 h后，60和80 μmol/L的隱丹參酮均可下調(diào)VEGF mRNA的表達(dá)(均P＜0.01)。結(jié)論隱丹參酮可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并能抑制VEGF mRNA的表達(dá)，提示這可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

隱丹參酮;人胃癌SGC-7901細(xì)胞;四甲基偶氮唑藍(lán);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

隱丹參酮(cryptotanshinone，CPT)是從活血化疲中藥丹參中提取出的有效成分，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，能夠在一定程度上阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲和防止其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有抗腫瘤細(xì)胞的活性，且抗瘤譜較廣，日益受到關(guān)注［1］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前最重要的血管生成刺激因子之一，在腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中起著重要作用，可誘導(dǎo)體外內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移及體內(nèi)血管生成［2］。本研究檢測(cè)不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及VEGF mRNA表達(dá)的影響，探討隱丹參酮抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑

隱丹參酮購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(HPLC≥98%);胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所;RPMI 1640培養(yǎng)基及細(xì)胞消化液胰酶(Tyrisin)為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)、二甲基亞礬(DMSO)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;VEGF和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物由TAKARA公司合成; RNAiso Reagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

倒置顯微鏡(IMT-2)產(chǎn)自O(shè)lympus公司;超凈工作臺(tái)產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CO2孵箱產(chǎn)自Thermo Electron公司;-80℃超低溫冰箱產(chǎn)自日本SANYO公司;酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)Bio-rad公司;7300 Real Time PCR System產(chǎn)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制試驗(yàn)(MTT法)

隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲(chǔ)備液，過濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO的終濃度≤0.1%(V/V)。

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)4 h后，設(shè)空白對(duì)照組和5個(gè)不同濃度的隱丹參酮組(終濃度為20、40、60、80、100 μmol/L)，每種濃度5個(gè)復(fù)孔。除空白對(duì)照組外，每孔中加入相應(yīng)濃度的隱丹參酮，分別刺激6、12、24、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;小心吸去培養(yǎng)液;每孔加入150 μL DMSO，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570 nm/630 nm(主波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)630 nm)測(cè)量各孔的吸光值并計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。每組去掉一個(gè)OD值最低值和一個(gè)最高值，取剩余3個(gè)復(fù)孔OD值來計(jì)算。

1.2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)4 h后，設(shè)空白對(duì)照組和3個(gè)不同濃度的隱丹參酮組(終濃度為40、60、80 μmol/L);于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h，收取各組細(xì)胞用Real Time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞的VEGF mRNA的表達(dá)。

1.2.2.1 抽提總RNA按RNAiso Reagent操作說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分析及電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。

1.2.2.2 單鏈cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒，嚴(yán)格按說明書操作。各目的基因的引物序列［3］及產(chǎn)物大小如下:VEGF:Forward 5’-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3’，Reverse 5’-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3’，417 bp;β-actin:Forward 5’-CCATG TACGTTGCTATCCAGG-3’，Reverse 5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3’，252 bp。

1.2.2.3 Real Time PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒，應(yīng)用ABI 7300 Real Time PCR System采用兩步法PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，10 s(1個(gè)循環(huán)); PCR反應(yīng)95℃，5 s，60℃，31 s(40個(gè)循環(huán))。

1.2.2.4 產(chǎn)物分析使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程各檢測(cè)樣本的閡循環(huán)(Threshold cycle，CT)，閡循環(huán)值隨模板濃度增大而減少。每個(gè)樣本均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，內(nèi)參照基因亦設(shè)5個(gè)復(fù)孔。采用2-△△CT的方法［4］分析VEGF mRNA表達(dá)水平

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

以20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細(xì)胞6～48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制情況。實(shí)驗(yàn)表明，隱丹參酮能明顯抑制SGC 7901細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，尤以刺激24 h和48 h明顯，呈劑量與時(shí)間依賴性。由于刺激48 h后，最低濃度的隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率已超過50%，故選取24 h作為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間。見表1。

刺激24 h后，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關(guān)系(y=0.498x+20.56，R2=0.972)，并由此計(jì)算出隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為59.11 μmol/L，故選取40、60、80 μmol/L 3個(gè)劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中隱丹參酮的給藥濃度。

表1 不同濃度隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(%，±s，n=3)

組別刺激6 h刺激1 2 h刺激2 4 h刺激4 8 h 2 0 μ m o l / L隱丹參酮組4 0 μ m o l / L隱丹參酮組6 0 μ m o l / L隱丹參酮組8 0 μ m o l / L隱丹參酮組1 0 0 μ m o l / L隱丹參酮組9 . 0 8 ± 1 . 2 0 9 . 5 2 ± 3 . 3 6 2 0 . 7 4 ± 0 . 3 0 1 9 . 8 6 ± 2 . 1 5 2 5 . 7 4 ± 0 . 9 6 1 2 . 9 3 ± 1 . 0 6 1 1 . 6 7 ± 1 . 0 4 2 0 . 8 3 ± 0 . 2 4 2 4 . 6 3 ± 1 . 4 8 3 0 . 9 3 ± 3 . 1 5 3 3 . 2 3 ± 4 . 7 2 3 9 . 3 2 ± 4 . 2 8 4 6 . 4 4 ± 7 . 0 3 6 1 . 3 0 ± 5 . 4 1 7 2 . 0 9 ± 5 . 3 1 5 1 . 6 8 ± 2 . 4 6 5 6 . 4 3 ± 2 . 9 4 5 8 . 7 6 ± 4 . 3 8 6 5 . 4 7 ± 3 . 3 8 7 4 . 8 4 ± 5 . 0 3

2.2 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

以40、60、80 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，通過2-ΔΔCT法計(jì)算各組SGC-7901細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)水平，見表2。

由表2和圖1可見，與空白對(duì)照組相比，40 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達(dá)量雖有所減低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而60 μmol/L和80 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達(dá)量均較空白對(duì)照組明顯降低(均P＜0.01)，且有隨藥物濃度的增加而逐漸減少的趨勢(shì)，其量效曲線呈對(duì)數(shù)關(guān)系，y=-0.6854Ln(x)+3.3759，R2=0.9884。

表2 不同濃度隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響(±s，n=5)

注:與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01;與40 μmol/L隱丹參酮組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;VEGF:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;CT:閡循環(huán)

組別V E G F CT平均值β -a c t i n CT平均值V E G F m R N A表達(dá)量空白對(duì)照組4 0 μ m o l / L隱丹參酮組6 0 μ m o l / L隱丹參酮組8 0 μ m o l / L隱丹參酮組2 7 . 6 9 ± 0 . 2 7 2 8 . 0 5 ± 0 . 2 0 2 8 . 7 1 ± 0 . 1 6 2 9 . 2 1 ± 0 . 3 2 2 0 . 2 1 ± 0 . 1 5 2 0 . 3 2 ± 0 . 3 1 2 0 . 2 7 ± 0 . 3 2 2 0 . 3 6 ± 0 . 1 6 0 . 9 6 ± 0 . 2 4 0 . 8 6 ± 0 . 1 9 0 . 5 4 ± 0 . 1 6**#0 . 3 9 ± 0 . 0 7**##

3 討論

胃癌在全世界的發(fā)病率都很高，根治性切除術(shù)是目前唯一可以治愈胃癌的方法，但大部分患者術(shù)后會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［5］。因此，研究更有效的治療藥物以延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量一直是備受關(guān)注的熱點(diǎn)。

中藥以其天然、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)為抗腫瘤研究提供了新的思路和方法。隱丹參酮是中藥丹參中具有很強(qiáng)代表性的脂溶性有效組分。大量研究證實(shí)，隱丹參酮具有廣譜的胞毒效應(yīng)，如黑色素瘤、膽管癌、白血病等［6-8］，故其在腫瘤治療方面具有較大的臨床藥用開發(fā)價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能明顯抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，藥物作用顯示出顯著的劑量-時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系;且24 h為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間，IC50為59.11 μmol/L。

腫瘤血管的生成是腫瘤無限增殖和轉(zhuǎn)移的必要條件［9］，而腫瘤血管的生成是由一系列促血管生成因子而引發(fā)和維持的病理血管生成過程。VEGF是目前最重要的促血管生成因子之一，且在腫瘤組織中有較高表達(dá)［10-11］。抑制VEGF的表達(dá)不但可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，還可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，故抗腫瘤血管生成可能成為治療腫瘤新的方法。卞維鵬等［12］研究表明，隱丹參酮是一種新的小分子血管生成抑制劑，由此推測(cè)隱丹參酮可能通過抑制血管生成起到一定的抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的隱丹參酮(40、60、80 μmol/L)作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后，經(jīng)Real Time RT-PCR法檢測(cè)后表明:VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)，且隨藥物濃度的增加而逐漸減少。

綜上所述，隱丹參酮不僅能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，還能通過抑制腫瘤細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)而具有潛在的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，但機(jī)制尚不十分清楚。隨著研究的不斷深入，將會(huì)更深層次地探究隱丹參酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抗腫瘤血管生成的分子機(jī)制。

［1］弓建華，陳春雷.隱丹參酮抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，30(1):87-90.

［2］王國(guó)平，尹成進(jìn)，歐陽曙明，等.雷公藤內(nèi)醋醇對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖及表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(1):17-19.

［3］周軍，鄭軍，肖文波，等.丹參酮ⅡA對(duì)人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(12):1798-1801.

［4］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T))Method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［5］蘇丹，張婷婷，王李杰，等.胃癌抗血管生成靶向治療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(9):14-18.

［6］Chen L，Zheng SZ，Sun ZG，et al.Cryptotanshinone has diverse effects on cell cycle events in melanoma cell lines with different metastatic capacity［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2011，68(1):17-27.

［7］陳春雷，弓建華，繆輝來，等.隱丹參酮對(duì)人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖、survivin基因及caspase-3蛋白表達(dá)的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)院，2013，31(1):4-7.

［8］羅聰，劉加軍.隱丹參酮對(duì)U937細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)制［J］.山東醫(yī)藥，2012，52(21):14-16.

［9］劉紅英.胃癌組織中三葉因子、環(huán)氧化酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(16):58-59，65.

［10］鐘崇，郭榮平，石明，等.VEGF與MMP-9在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.癌癥，2006，25(5):599-603.

［11］雷杰，費(fèi)建東，劉振顯，等.乳腺癌組織中Ang-2及VEGF的表達(dá)及意義［J］.腫瘤防治研究，2008，35(4):263-265.

［12］卞維鵬，徐瑩，陳菲，等.隱丹參酮對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用［J］.中國(guó)微循環(huán)，2007，11(1):23-26.

Effect of cryptotanshinone on the proliferation and vascular endothelial growth factor mRNA expression in human gastric cancer cell line SGC-7901

DENG Fengchun1YU Zhanjiang2YANG Yu2ZHAO Hongye3WANG Bin3ZHOU Li31.Department of Anatomy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Department of General Surgery，The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161001，China；3.Department of Physiology，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To observe the effect of cryptotanshinone on cell proliferation and vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA expression in human gastric cancer cell line SGC-7901，and to explore its possible anti-tumor mechanism.Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells were cultured in vitro and treated with cryptotanshinone. The cell proliferation was examined by the method of MTT.The transcriptions of VEGF mRNA were demonstrated by real-time RT-PCR.Results The cryptotanshinone groups with 20，40，60，80，100 μmol/L five different concentrations had significant inhibitory effects on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in 6，12，24 h and 48 h after drug action.This effect increased with increasing drug concentration and action time.24 h was the best time of cryptotanshinone action，and IC50of 24 h was 59.11 μmol/L.In the following study，the effects of cryptotanshinon groups with 40，60，80 μmol/L three different concentrations on human gastric cancer SGC-7901 cells were observed，the results indicated that 60 and 80 μmol/L cryptotanshinon down-regulated the expression of VEGF mRNA(both P＜0.01).Conclusion Within a certain drug concentration，cryptotanshinone can inhibit the proliferation of SGC-7901 cells and plays a potential role in inhibiting angiogenesis by down-regulating the expression of VEGF mRNA.

Cryptotanshinon；Human gastric cancer cell line SGC-7901；MTT;VEGF；Real-time quantitative reverse transcription-PCR

R735.2，R285.5

A

1673-7210(2015)02(c)-0007-04

2014-11-24本文編輯:程銘)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)1253-1830)。

鄧?guó)P春(1975.12-)，男，吉林長(zhǎng)春人，碩士，主要從事中藥抗腫瘤及其轉(zhuǎn)移研究。