李 茜，李慶淑，李 智，曲 彥，胡 丹

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院，山東 青島 266071）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacterbaumannii，AB）是一種非發(fā)酵的革蘭陰性條件致病菌，可引起各組織和器官感染，包括肺炎、腦膜炎、菌血癥、尿路感染和傷口感染等［1］。碳青霉烯類抗生素具有廣譜抗菌活性，是目前臨床上治療重癥感染的主要抗菌藥物。但近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，對碳青霉烯藥物耐藥的AB已在全球流行，其治療已成為世界性難題，對其耐藥機(jī)制的研究具有重要意義。產(chǎn)碳青霉烯酶是AB對碳青霉烯耐藥的重要原因，水解藥物的碳青霉烯酶主要有B類金屬酶和D類OXA型酶。為了解青島市兩所醫(yī)院AB耐藥情況及碳青霉烯酶基因攜帶情況，筆者對臨床收集的145株AB進(jìn)行耐藥分析，檢測其碳青霉烯酶基因攜帶情況，并進(jìn)行同源性分析，了解菌株耐藥性的演變和耐藥基因分布，為臨床抗菌藥物的合理使用，預(yù)防和控制醫(yī)院感染流行提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集青島市兩所醫(yī)院2013年7月—2014年7月住院患者臨床標(biāo)本分離的AB，共145株，其中A院78株，B院67株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 藥敏試驗 采用紙片擴(kuò)散法測定細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，試驗結(jié)果判斷參照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)菌DNA模板制備 取菌環(huán)挑取單一菌落置于LB液體培養(yǎng)液中，在搖箱中過夜培養(yǎng)（37℃，180 r/min），取 渾濁的菌液于1.5 mL EP 管 內(nèi)，6 000 r/min離心10 min，棄上清，向EP管內(nèi)加入200μL高壓超純水，吹打混勻后100℃水浴10 min，隨后4℃冷卻5 min；4℃，12 000 r/min離心3 min；吸取上清液移入另一新的0.5 mL EP管內(nèi)，即為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測模板，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4 基因檢測 PCR反應(yīng)體系為25μL，含3μL DNA模板，0.2μL Taq酶，2.5μL10×Taq緩沖液（含15 mmol/L MgCl2），2μL2.5 mmol/L dNTP，10μmol/L上下游引物各1μL，15.3μL水。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（溫度51～58℃），72℃延伸60s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。腸桿菌基因間一致重復(fù)序列（ERIC）-PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。產(chǎn)物長度＜500 bp，采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；產(chǎn)物長度＞500 bp，采用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外投射儀觀察結(jié)果。各靶基因引物序列見表1。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 The sequences of PCR primers and length of products

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用秩和檢驗對兩院AB耐藥情況進(jìn)行比較，χ2檢驗對兩院耐藥基因攜帶率進(jìn)行比較，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本類型及科室分布 兩所醫(yī)院標(biāo)本主要分離自痰（A院75.64%，B院85.07%）、分泌物（A 院11.54%）、組織、引流液、尿、導(dǎo)管末端、胸腔積液等。A院標(biāo)本主要分離自重癥監(jiān)護(hù)室（ICU，37.18%）、高壓氧病區(qū)（15.38%）、干部病房（12.82%）和手外科（8.97%）；B院標(biāo)本主要分離自ICU（79.10%）和呼吸科（8.96%）。

2.2 藥敏結(jié)果 A院碳青霉烯耐藥AB68株，敏感10株；B院碳青霉烯耐藥AB60株，敏感7株。A院AB對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低（3.85%），其次是米諾環(huán)素（16.67%）；對其他抗菌藥物耐藥率均＞73%。B院AB對米諾環(huán)素和替加環(huán)素均不耐藥，對阿米卡星和左氧氟沙星的耐藥率分別為23.88%、38.81%，對其他抗菌藥物的耐藥率均＞64%。兩院菌株對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素的耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；其他抗菌藥物耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 兩院AB耐藥情況比較（株）Table 2 Comparison in antimicrobial resistance of AB between two hospitals（No.of isolates）

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 兩院所有菌株均攜帶OXA-51基因，均未檢出SIM-1、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、OXA-24基因。A、B兩院碳青霉烯耐藥組OXA-23基因的攜帶率分別為 86.76%（59/68），56.67%（34/60），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝14.53，P＜0.001）；兩院碳青霉烯敏感組OXA-23基因均為陰性。A院3株菌攜帶OXA-58基因，B院未檢出OXA-58基因。電泳結(jié)果見圖1。

2.4OXA-23基因陽性與陰性株耐藥率 除頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素、頭孢呋辛外，A院OXA-23基因陽性株和陰性株對其他抗菌藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；除亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/他唑巴坦外，B院OXA-23基因陽性株和陰性株對其他11種抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

圖1 AB碳青霉烯酶基因檢測PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis results of PCR products of AB carbapenemase genes

表3 兩院AB對常用抗菌藥物的耐藥率（%）Table 3 Antimicrobial resistant rates of AB from two hospitals（%）

2.5 同源性分析 根據(jù)ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型（見圖2），運(yùn)用BIO-1D軟件分析各菌株所有條帶分子量大小進(jìn)行聚類分析。兩院所有菌株共分為8個基因型（分別用 A、B、C、D、E、F、G、H 表示），其中A型71株和E型37株，為主要流行株。A型又分為4個亞型，E型分為3個亞型。聚類分析見圖3。A院菌株共分為6種類型（除D、F型）主要是 A 型（46.15%）和E型（41.03%）；B院共分為8種類型，主要是 A 型 （52.24%）和 C 型（17.91%）。見表4。

表4 兩院AB基因分型構(gòu)成Table 4 Constituent ratios of genotypes of AB from two hospitals

圖2 AB ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoresis results of ERIC-PCR in AB strains

圖3 基于ERIC-PCR譜型的兩院AB聚類分析結(jié)果Figure 3 Hierarchical clustering of AB strains from two hospitals based on ERIC-PCR electrophoresis patterns

3 討論

AB是醫(yī)院感染的重要病原菌，隨著抗菌藥物的廣泛運(yùn)用，其耐藥株逐年增加，并且開始由低耐藥向高耐藥，單一藥耐藥向多藥耐藥方向發(fā)展，世界各地也陸續(xù)出現(xiàn)有關(guān)多重耐藥 AB（multidrugresistantAcinetobacterbaumannii，MDR-AB）或泛耐藥 AB（extensively drug-resistantAcinetobacter baumannii，XDR-AB）的報道［2］。本研究顯示，兩院分離的AB主要來源于痰標(biāo)本，表明AB在兩所醫(yī)院主要為下呼吸道感染；其在ICU分離率較高，可能與患者自身多有嚴(yán)重疾病、免疫能力較差，且長期使用廣譜抗菌藥物及侵入性操作（如氣管插管、氣管切開、吸痰、靜脈置管）等有關(guān)。池細(xì)俤等［3］采用多因素回歸分析結(jié)果顯示，氣管切開和使用呼吸機(jī)是MDRAB感染的獨(dú)立危險因素。另外A院的高壓氧病區(qū)和干部病區(qū)的AB分離率也較高，可能與手衛(wèi)生差、抗菌藥物使用不合理、侵入性操作、年齡等有關(guān)。

兩院AB耐藥性分析顯示，耐藥情況嚴(yán)重，呈現(xiàn)多重耐藥和泛耐藥。對氨基青霉素、第一代和第二代頭孢菌素、第一代喹諾酮類抗菌藥物幾乎完全耐藥；對舒巴坦復(fù)方制劑仍有較高的敏感性，可能與舒巴坦能直接作用于青霉素結(jié)合蛋白，并可以抑制細(xì)菌產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)［4］。兩院菌株耐藥情況比較對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素差異無統(tǒng)計學(xué)意義，對其他抗菌藥物差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與兩院環(huán)境及抗菌藥物選擇不同有關(guān)。

目前，關(guān)于AB對碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制中產(chǎn)碳青霉烯酶的相關(guān)報道［5-7］最多。碳青霉烯酶是指能夠水解碳青霉烯類藥物的1類β-內(nèi)酰胺酶，在我國主要是B類酶和D類酶。國際上，該菌所產(chǎn)的B類金屬酶主要有IMP型、VIM型及SIM-1型，D類 OXA 型酶主要為OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58。報道［8］稱OXA-51/66是AB天然固有的碳青霉烯酶基因。本實(shí)驗中所有菌株均攜帶OXA-51基因，再次證明所有菌株均為AB。OXA-23基因在碳青霉烯敏感組中均為陰性，而耐藥組中OXA-23基因攜帶率兩院相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外OXA-23基因與某些抗菌藥物的耐藥情況有一定關(guān)聯(lián)性，陽性菌株耐藥率高于陰性株；且兩院存在一定的差異，可能尚存其他多種耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。B類金屬酶基因SIM-1、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2及OXA-24基因在兩院中均為陰性，與國內(nèi)其他地區(qū)報道［9-10］一致。A院3株 AB攜帶OXA-58基因，B院菌株OXA-58基因均為陰性。以上結(jié)果提示，兩院AB對碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制與產(chǎn)D類碳青霉烯酶有關(guān)，且主要產(chǎn)OXA-23與OXA-51型酶，尚未發(fā)現(xiàn)B類金屬酶基因。

耐碳青霉烯AB的出現(xiàn)，使臨床治療和預(yù)防感染面臨很大挑戰(zhàn)，監(jiān)測其耐藥率和流行型別十分重要。ERIC-PCR是目前常用的簡便、快速的基因分型技術(shù)，其分辨率較強(qiáng)，結(jié)果可靠，與細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型有一定相關(guān)性［11］。ERIC-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物多為一端有ERIC序列，而另一端為隨機(jī)序列，小部分產(chǎn)物兩端均為隨機(jī)序列，可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶位置分析基因的同源性。本研究中，兩院所有菌株共分為8個基因型，其中A型71株和E型37株，為主要流行株。A院主要流行A型和E型，主要分布在ICU、呼吸內(nèi)科、高壓氧病區(qū)；B院主要流行A型和C型，主要分布在ICU、呼吸內(nèi)科；其余型別以散發(fā)形式存在。A院3株OXA-58基因陽性株分屬不同類型，說明A院未出現(xiàn)攜帶OXA-58基因的AB水平傳播。其中A、B、C、D四個克隆型的譜帶有較高程度的相似性，它們間的親緣關(guān)系緊密。對于這些親緣關(guān)系較近的菌株，可能來自于同一感染源或為某克隆系在外界環(huán)境條件的影響下分化形成的不同克隆型及亞型，具有追溯感染源的意義。A型菌株在兩所醫(yī)院均存在暴發(fā)流行，應(yīng)深入研究這些攜帶A型菌株患者的臨床資料，探討是否因為相同或相似的臨床感染、用藥模式、傳播途徑等而分離出相同的細(xì)菌菌型。此外，ERIC分型的每一種型別均分散著OXA-23基因陽性株與陰性株，故認(rèn)為攜帶此耐藥基因與ERIC分型不一致，可能與細(xì)菌合并多種耐藥機(jī)制，并可通過整合子等移動元件進(jìn)行水平傳播有關(guān)。以上結(jié)果提示在這一時期內(nèi)，兩所醫(yī)院存在某種MDRAB的暴發(fā)流行，可能以克隆株的形式在病房內(nèi)和病房間，甚至醫(yī)院間進(jìn)行傳播，這可能是造成兩院MDRAB分離率及耐藥率逐年升高的重要原因。

［1］Durante-Mangoni E，Zarrilli R.Global spread of drug-resistantAcinetobacterbaumannii:molecular epidemiology and management of antimicrobial resistance［J］.Future Microbiol，2011，6（4）:407-422.

［2］陳海紅，李華茵，何禮賢.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2010，9（4）:439-443.

［3］池細(xì)俤，高世華，陳家龍，等.多重耐藥鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染危險因素［J］.中國感染控制雜志，2014，13（9）:534-537.

［4］時露，段秀杰.鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制及藥物治療研究進(jìn)展［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26（3）:379-381.

［5］明德松，許鈺穎，鄧勇.我國鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類藥物機(jī)制的 Meta分析［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2013，8（4）:358-360，381.

［6］Ergin A，Hascelik G，Eser OK.Molecular characterization of oxacillinases and genotyping of invasiveAcinetobacterbaumanniiisolates using repetitive extragenic palindromic sequencebased polymerase chain reaction in Ankara between 2004 and 2010［J］.Scand J Infect Dis，2013，45（1）:26-31.

［7］Taitt CR，Leski TA，Stockelman MG，et al.Antimicrobial resistance determinants inAcinetobacterbaumanniiisolates taken from military treatment facilities［J］.Antimicrob Agents Chemother，2014，58（2）:767-781.

［8］Poirel L，Naas T，Nordmann P.Diversity，epidemiology，and genetics of class D beta-lactamases［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）:24-38.

［9］李光榮，宋敏，楊建波，等.碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2014，17（26）:3083-3087.

［10］杜坤，應(yīng)春妹，汪雅萍，等.上海地區(qū)四家醫(yī)院鮑曼不動桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27（2）:103-109.

［11］李永麗，應(yīng)春妹，陳藝升.ERIC-PCR技術(shù)在鮑曼不動桿菌基因分型中的應(yīng)用評估［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28（7）:621-624.