王 倩,劉麗煒,朱泠西,鄒 鵬,胡思怡,卜承飛

(長春理工大學理學院國際納米光子學與生物光子學聯合研究中心,吉林長春 130022)

低分子量聚乙烯亞胺/金納米棒納米載體的制備及毒性研究

王 倩,劉麗煒*,朱泠西,鄒 鵬,胡思怡,卜承飛

(長春理工大學理學院國際納米光子學與生物光子學聯合研究中心,吉林長春 130022)

以表面修飾巰基十一烷酸的金納米棒(GNRs/MUA)為骨架,將低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)連接到GNRs/MUA表面,構建GNRs/MUA/PEI納米載體。首先采用MUA對GNRs進行表面修飾,減少由于GNRs表面的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)所造成的生物毒性。然后采用低分子量PEI進一步修飾,同時利用GNRs巨大的比表面積進一步放大PEI的攜帶基因能力,這樣既能夠降低陽離子聚合物的毒性,又能夠提高整個體系的轉染效率。利用透射電子顯微鏡(TEM)、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、Zeta電位等對納米載體進行了表征。結果顯示,MUA與PEI已成功修飾到GNRs表面,并很好地保留了GNRs的光學性質,其表面電位發(fā)生正負交替變化。采用噻唑藍(MTT)比色法對納米載體進行細胞毒性研究,結果顯示GNRs/MUA/PEI (1.8 kDa)非病毒納米載體,細胞存活率在控制聚合物濃度為300 μg/mL時仍然穩(wěn)定在75％以上,明顯高于商品化的PEI(25 kDa)。

金納米棒;聚乙烯亞胺;非病毒載體;細胞毒性

1 引 言

基因療法在介入治療領域應用廣泛,可以治療多種疾病,包括傳染病、遺傳病、癌癥等。它克服了蛋白治療的缺點,成為一種新的治療方法,引起了越來越多科研學者的極大興趣和廣泛關注。然而,限制基因治療的一個關鍵因素是安全高效基因載體的制備?；蜉d體一般分為病毒類和非病毒類。相對于病毒載體,非病毒基因載體具有低細胞毒性和低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等優(yōu)點,因此應用最為廣泛,主要包括有脂質體、陽離子聚合物和納米顆粒等[1-5]。金納米棒(Gold nanorods,GNRs)是一種棒狀的金納米顆粒,它比球形金納米粒子具有更大的比表面積和更為奇特的光電性質[6],具有合成方法簡單、化學性質穩(wěn)定、產率高、低毒性、易于官能化等優(yōu)點,可作為小分子藥物及大生物分子如DNA、SiRNA的輸送載體,展現出了良好的應用前景。到目前為止,研究者們已經能夠制備出多種形貌的金納米顆粒。其中棒狀金納米顆粒具有更為特殊的表面等離子體共振(SPR)特性,通過控制不同長短軸比可以人為調控縱向SPR峰位置(從可見光區(qū)到近紅外光區(qū))。另外,GNRs能夠有效地吸收紅外光能量進行局部加熱,導致蛋白質變性并致細胞死亡,在疾病的光熱治療中具有特殊的優(yōu)越性[7-9]。

陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI),富含氨基,可以通過靜電作用與DNA或SiRNA等生物分子締合成復合物。由于其獨特的“質子海綿效應”,能夠保護DNA免受核酸酶降解,促進與細胞的結合和攝取,成為陽離子聚合物基因載體的典型代表,在大多數的體外基因轉染和動物體內基因治療研究中均取得了良好的效果[10-14]。但同時它也會對細胞產生較大的毒性作用,同時不可降解,限制了其在生物醫(yī)學領域的應用[12,15]。研究發(fā)現,降低相對分子質量可以減少聚乙烯亞胺的毒性,但同時轉染效率下降[16-18]。因此,越來越多的研究者們投入到進一步提高聚乙烯亞胺的轉染效率并降低其毒性的研究中。本文將低分子量的PEI與GNRs相結合,采用低分子量PEI降低陽離子聚合物的細胞毒性,同時利用GNRs巨大的比表面積進一步放大PEI的攜帶基因能力,構建GNRs/MUA/PEI基因載體。這樣既能夠降低陽離子聚合物的毒性,又能夠提高整個體系的轉染效率。利用MTT法檢測GNRs/MUA/PEI (1.8 kDa)對MCF-7細胞的細胞毒性,結果證實GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)對細胞毒性較小,體現了其作為新型非病毒納米載體的可行性及優(yōu)越性,為開發(fā)高效基因及藥物運輸載體提供了一個新的思路。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

儀器:樣品的吸收光譜通過紫外可見近紅外分光光度計(Carry5000,美國,安捷倫)檢測,高倍透視電鏡(FEI Tecnai G2 S-Twin)觀察制備的GNRs的形貌和尺寸。膠體粒度Zeta電位測定儀(Nano ZS90,德國,馬爾文)用于測定樣品的水合粒徑及表面電位。利用多功能酶標儀(Infinite M200 Pro,瑞士,TECAN)進行MTT測試。

試劑:氯金酸(HAuCl4·3H2O,99％)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB,99％)、抗壞血酸(Ascorbic acid,AA,99％)、硝酸銀(AgNO3,99.9％)、硼氫化鈉(NaBH4,98％)、聚乙烯亞胺(PEI,25 kDa,99％)、11-巰基十一酸(11-mercaptoundecanoic acid,MUDA,95％)均購自Sigma公司。聚乙烯亞胺(PEI,1.8 kDa,99％)購自Alfa公司。pH 7.2的PBS緩沖溶液、DMEM(GIBCO)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、胰酶細胞消化液(Typsin-EDTA solution)、抗生素(Penicillin-streptomycin)、甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)均購自碧云天生物技術有限公司。

2.2 金納米棒的合成

目前,對于GNRs的合成已經研究出許多有效的方法,如模板法、電化學法、光化學法以及晶種生長法等。晶種法對設備的要求比較低且制備過程較簡單,是目前制備GNRs最成功的方法[19-22],因此本文采用晶種生長法制備GNRs。

在10 mL濃度為0.1mol/L的CTAB溶液中加入0.2 mL濃度為0.01 mol/L的HAuCl4溶液,緩慢攪拌,溶液立即由淺黃色轉為棕黃色。然后,迅速加入500 μL濃度為0.01 mol/L的冰的NaBH4,溶液呈金棕色,繼續(xù)緩慢攪拌2 min,即得到金種溶液待用。

分別配制適量濃度為25 mmol/L的HAuCl4、濃度為0.2 mol/L的抗壞血酸(AA),濃度為0.1mol/L的CTAB溶液。取一個試劑瓶,取適量上述溶液依次加入試劑瓶中,反應一定時間配制成50 mL生長液。

將0.5 mL金種加入到50 mL生長液中,靜置在30℃水浴中過夜,即得到GNRs/CTAB溶液。

2.3 GNRs/MUA/PEI的制備

GNRs/MUA/PEI納米載體的制備原理如圖1所示。首先,取22 mg MUA固體于一支10 mL玻璃試劑瓶中,加入4 mL HPLC水,超聲分散至溶液呈白色懸濁液。加入800 μL 20％的NaOH,緩慢攪拌5 min后得到透明溶液,補加水到5 mL,得到濃度為23 mmol/L的MUA溶液。向裝有5 mL濃度為3 mg/mL的GNRs溶液的試劑瓶中緩慢加入1 mL濃度為23 mmol/L的MUA溶液,常溫反應24 h。以6 000 r/min的轉速離心20 min,移去上清液,向其中加入5 mL水,超聲分散,得到GNRs/MUA溶液。

然后,取濃度為1 mg/mL的PEI溶液加入到1 mL的GNRs/MUA溶液中,室溫下反應30 min。以4 500 r/min的轉速離心15 min,去除未結合的反應物。之后,向其中加入1 mL水溶解,待用。

圖1 GNRs/MUA/PEI納米載體的制備原理示意圖Fig.1 Synthetic scheme of GNRs/MUA/PEI

2.4 毒性測試

將對數生長期的MCF-7細胞分散在含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中。細胞計數之后,將其置于96孔板中,每孔約10 000個細胞,在CO2孵育箱中孵育12 h(37℃、體積分數為5％的飽和濕度),使其貼壁。分別將20 μL的細胞培養(yǎng)液和不同濃度的GNRs/CTAB、GNRs/MUA、PEI(1.8 kDa)、PEI(25 kDa)、GNRs/MUA/PEI(25 kDa)、GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)加入96孔板。不同聚合物在體系中的最終濃度分別為25,50,100, 200,300 μg/mL。第一組孵育時間為24 h,第二組孵育時間為48 h。

3 結果與討論

3.1 不同長徑比GNRs的表征

圖2為采用晶種生長法制備的GNRs的透射電鏡(TEM)圖像,GNRs的長徑比分別為2∶1、3.5∶1、4.5∶1,0.3 mol/L鹽酸的加入量分別為200,400,600 μL。由圖2可以看出,所制備的GNRs大小尺度均一,表面光滑,分散性較好。通過改變實驗條件,可以調控GNRs的紅外共振吸收峰位置。圖3分別為加入200,400,600,800 μL鹽酸所制備的不同長徑比的GNRs的吸收光譜。由圖中可知,隨著鹽酸加入量的增加,GNRs的縱向等離子共振吸收峰發(fā)生了不同程度的紅移,從640 nm紅移至850 nm,表明GNRs的長徑比不斷增大。

結果顯示,通過控制溶液中鹽酸的加入量可以有效地控制金納米粒子的長徑比。這是由于隨著酸的加入,溶液的pH值隨之減小,CTAB的吸附特性也隨之改變。CTAB強吸附在{110}面上形成雙層從而抑制金納米顆粒在{110}面上的生長,所以金納米棒的寬度(側面)生長減慢,GNRs的長徑比不斷增大。

圖2 長徑比分別為2∶1、3.5∶1、4.5∶1的GNRs的實物圖及對應的TEM圖。Fig.2 TEM images of GNRs with aspect ratios of 2∶1,3.5∶1,and 4.5∶1,respectively.

圖3 不同長徑比的GNRs的吸收光譜Fig.3 Surface plasmon absorption spectra of GNRs with different aspect ratios

3.2 不同長徑比的金納米棒的膠體穩(wěn)定性測試

為了選擇穩(wěn)定性較好的GNRs進行進一步的研究應用,我們對所制備的不同長徑比的GNRs進行了膠體穩(wěn)定性測試。首先通過調節(jié)實驗中加入鹽酸的量,制備不同長徑比的GNRs。然后利用動態(tài)光散射粒度分析設備測定了不同長徑比的GNRs在水溶液中的膠體穩(wěn)定性,以便于后續(xù)修飾以及生物應用。從圖4中的結果可以發(fā)現,長徑比為2∶1的GNRs的水合粒徑穩(wěn)定在50 nm左右,無大幅度變化,其分散性及穩(wěn)定性較好,所以在后面的實驗中我們選用的GNRs長徑比約為2∶1。

圖4 長徑比分別為2∶1、3.5∶1、4.5∶1的GNRs在水溶液中的膠體穩(wěn)定性。Fig.4 Colloid stability of GNRs at the aspect ratios of 2∶1, 3.5∶1,and 4.5∶1,respectively.

3.3 GNRs/MUA/PEI納米粒子的物理表征

由于MUA與陽離子聚合物PEI修飾到GNRs表面會導致其Zeta電位發(fā)生明顯的正負交替變化,因此由圖5的結果可知,MUA與PEI已成功修飾到GNRs表面。由于表面修飾前GNRs的表面吸附了大量的CTAB分子,Zeta電位為+36.8 mV,其表面帶正電;修飾MUA后,其Zeta電位變?yōu)?46.4 mV,說明MUA通過S—Au鍵成功地共價連接起來,其表面的CTAB被MUA分子替換,使金納米棒表面帶負電[23]。經過不同分子量的PEI修飾后,GNRs的Zeta電位分別為+32.4 mV和+48.5 mV,證明陽離子聚合物已成功地通過靜電吸附作用吸附到GNRs/MUA表面。

圖5 GNRs、GNRs/MUA、GNRs/MUA/PEI的Zeta電位圖。Fig.5 Zeta potential of GNRs,GNRs/MUA,and GNRs/ MUA/PEI,rspectively.

圖6 表面修飾后的GNRs的吸收光譜Fig.6 Surface plasmon absorption spectra of the surface functionalized GNRs

圖7 GNRs、GNRs/MUA、GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)、GNRs/MUA/PEI(25 kDa)納米顆粒的TEM圖像。Fig.7 TEM images of GNRs,GNRs/MUA,GNRs/MUA/ PEI(1.8 kDa),and GNRs/MUA/PEI(25 kDa), respectively.

圖6是經過不同表面修飾的GNRs溶液的可見-近紅外吸收光譜。從圖中可以看到,GNRs的吸收峰在650 nm處,GNRs/MUA、GNRs/MUA/ PEI的縱向吸收峰相比于GNRs均發(fā)生了不同程度的紅移。這是由于金納米棒所處的環(huán)境介質折射率發(fā)生了變化,這與理論上PEI的折射率大于MUA及CTAB分子層的折射率相符[24]。修飾后的GNRs峰形對稱、未發(fā)生展寬,說明聚合物未造成納米顆粒的團聚,GNRs/MUA、GNRs/MUA/PEI可以很好地保留GNRs的光學性質。圖7分別為修飾MUA和PEI的GNRs的TEM圖。從圖中可以看到,修飾后GNRs的長約為50 nm,寬約為20 nm,且修飾后的納米材料具有很好的分散性。

3.4 不同分子量PEI修飾的GNRs的細胞毒性

晶種生長法合成得到的GNRs表面被大量的CTAB所覆蓋。而GNRs表面的CTAB所具有的生物毒性對于GNRs在生物體系中的應用有很大的限制性[25-26]。因此,我們對GNRs初步離心去除一部分CTAB之后,再在其表面修飾MUA,分別與MCF-7細胞作用24 h和48 h后,測得的毒性結果如圖8所示,只加入培養(yǎng)基的細胞作為空白對照(Control)。GNRs在修飾MUA后的毒性明顯減小,生物兼容性增大,可以更好地應用于生物體系中。然后,我們再將低分子量的PEI修飾到GNRs的表面,測得的毒性結果如圖8所示。GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)的細胞毒性較小,改變聚合物的濃度從25～300 μg/mL,細胞存活率仍在75％以上,遠高于商品化的PEI(25 kDa)。在另一對照組中,我們采用高分子量的PEI(25 kDa)修飾GNRs/MUA,結果顯示,隨著聚合物濃度的增大,GNRs/MUA/PEI(25 kDa)對MCF-7細胞的毒性明顯增強。相比之下,GNRs/MUA/PEI (1.8 kDa)體現出明顯的優(yōu)越性。

圖8 MTT法檢測GNRs、GNRs/MUA、GNRs/MUA/PEI在不同濃度下與MCF-7細胞分別作用24 h(a)、48 h (b)的細胞毒性。Fig.8 Viability of MCF-7 cells incubated with GNRs, GNRs/MUA,GNRs/MUA/PEI for 24 h(a)and 48 h(b)at different concentrations.

我們采用另一對照組,分別對比GNRs/ MUA/PEI(1.8 kDa)與PEI(1.8 kDa)及GNRs/ MUA/PEI(25 kDa)、PEI(25 kDa)對MCF-7細胞的毒性。結果從圖9中可以看到,PEI(1.8 kDa)毒性較低;而當濃度不斷增大時,PEI(25 kDa)的細胞存活率明顯降低。這進一步證實了我們采用低分子量PEI制備納米載體的合理性。在相同濃度的情況下,GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)與PEI (1.8 kDa)相比無明顯變化。

4 結 論

采用晶種生長法制備GNRs,通過改變生長液中酸的加入量對GNRs的長徑比進行調控,從而選取穩(wěn)定性較高的樣品進行了表面修飾。然后分別將MUA與PEI修飾到GNRs表面,成功得到GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)納米載體。所制備的納米載體很好地保留了GNRs的光學性質。采用MTT比色法測試納米載體的細胞毒性,結果顯示GNRs/MUA/PEI(1.8 kDa)納米載體細胞毒性較小。改變聚合物的濃度從25～300 μg/mL,細胞存活率仍在75％以上,而相同條件下的PEI(25 kDa)細胞存活率僅在30％以上,可見其細胞存活率遠高于商品化的PEI(25 kDa)。GNRs/MUA/ PEI(1.8 kDa)納米載體的制備方法簡單,并且結合了PEI(1.8 kDa)低毒性和GNRs巨大表面積的優(yōu)勢,有望作為高效的納米載體運送基因及藥物應用于生物醫(yī)學領域。

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王倩(1990-),女,吉林長春人,碩士研究生,2013年于長春理工大學獲得學士學位,主要從事納米光子學與生物光子學的研究。

E-mail:wangqian1990mail@163.com

劉麗煒(1979-),女,吉林長春人,教授,博士生導師,2013年于長春理工大學獲得博士學位,主要從事納米光子學與生物光子學的研究。

E-mail:liulw@cust.edu.cn

Synthesization and Toxicity of Low-molecular-weight PEI/Gold Nanords Nanosystem

WANG Qian,LIU Li-wei*,ZHU Ling-xi,ZOU Peng,HU Si-yi,BU Cheng-fei
(International Joint Research Center for Nanophotonics and Biophotonics,School of Science, Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022,China) *Corresponding Author,E-mail:liulw@cust.edu.cn

Based on the gold nanorods modified by 11-mercaptopropanic acid(MUA)as the skeleton,the low molecular weight polyethylenimine PEI was conjugated to the surface of GNRs/MUA to form GNRs/MUA/PEI nanocomplexes.Firstly,surface modification of gold nanorods was carried out by using MUA to reduce the toxicity of gold nanorods caused by CTAB surfactants,and then further modified by low molecular weight PEI.The large surface area of gold nanorods allows them to carry more genes,which can simultaneously reduce the toxicity of cationic polymer and improve the transfection efficiency of the whole system.GNRs/MUA/PEI were characterized by transmission electron microscopy(TEM),UV-Vis absorption spectra,and Zeta potential.The results show that MUA and PEI are conjugated to GNRs successfully which cause charge reversal on the surface of GNRs,and the optical properties of GNRs are well preserved.In vitro cytotoxic effects of GNRs/MUA/PEI (1.8 kDa)are quantified by MTT assay,and the results suggest that the cell viability is above 75％ at the concentration of 300 μg/mL,much higher than the commercialized PEI(25 kDa).

gold nanorods;polyethylenimine;nonviral vectors;cytotoxicity

O482.31

:ADOI:10.3788/fgxb20153611.1271

1000-7032(2015)11-1271-07

2015-05-25;

:2015-09-28

國家自然科學基金(11204020);吉林省國際納米光子學與生物光子學重點實驗室支撐項目(20140622009JC);總裝備部預研基金(62201070711)資助項目