鐘金城, 柴志欣, 馬志杰, 王 永, 楊萬遠, 拉 環(huán)

1 西南民族大學， 動物遺傳育種學國家民委-教育部共建重點實驗室, 成都 610041 2 青海大學畜牧獸醫(yī)科學院, 青海高原牦牛研究中心, 西寧 810016 3 青海大通種牛場, 西寧 810016

野牦牛線粒體基因組序列測定及其系統(tǒng)進化

鐘金城1,*, 柴志欣1, 馬志杰2, 王 永1, 楊萬遠1, 拉 環(huán)3

1 西南民族大學， 動物遺傳育種學國家民委-教育部共建重點實驗室, 成都 610041 2 青海大學畜牧獸醫(yī)科學院, 青海高原牦牛研究中心, 西寧 810016 3 青海大通種牛場, 西寧 810016

野牦牛屬高寒地區(qū)的特有物種，是我國最珍貴的野生動物遺傳資源之一，已被列為國家一級重點保護動物。對野牦牛mtDNA進行全序列測定和結構分析，并基于線粒體基因組序列對其系統(tǒng)發(fā)生進行了探討。結果表明：(1)野牦牛線粒體基因組全序列的大小為16 322 bp，整個基因組由37個編碼基因和D-loop區(qū)組成；22個tRNA基因序列長度為1 524 bp、2個RNA基因序列長度為2 528 bp、13個編碼蛋白基因序列長度為11420 bp、D-loop區(qū)長度為892 bp。基因組中無間隔序列，基因間排列緊密，基因內(nèi)無內(nèi)含子。(2)野牦牛具有較豐富的遺傳多樣性。(3)分子系統(tǒng)發(fā)生關系顯示牦牛為牛亞科中的一個獨立屬，即牦牛屬(Poephagus)，牦牛屬包括家牦牛(Poephagusgrunniens)和野牦牛(Poephagusmutus)2個種。野牦牛線粒體基因組全序列的獲得和結構解析對研究牦牛的起源、演化和分類，以及野牦牛遺傳資源的保護、開發(fā)和利用均具有重要的理論和實際意義。

野牦牛; 線粒體基因組; 系統(tǒng)進化

野牦牛(Bosmutus)屬于?？?Bovidae)牛亞科(Bovinae)，是青藏高原珍貴而特有的野生物種資源，為國家一級重點保護野生動物，已被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》列為嚴禁貿(mào)易物種。目前，野牦牛種群數(shù)量為2萬余頭，分布于唐古拉山、昆侖山、巴顏喀拉山等高寒奇冷、氣候多變的高山寒漠地帶[1]。野牦牛體質(zhì)健壯、性情兇猛、其肉可食、皮可制革、毛可制繩索和編織帳篷，尾巴可制成拂塵撣和入藥，糞便曬干后可當燃料，是一種“全能”物種。野牦牛是家牦牛的近緣野生種，具有極強的抗寒能力和低氧適應能力。野牦牛是寶貴的遺傳資源，野牦牛與家牦牛雜交能產(chǎn)生顯著的雜種優(yōu)勢，其后代在生產(chǎn)性能、抗逆性等方面均較家牦牛有所提高，目前已經(jīng)利用野牦牛資源培育了“大通牦牛”新品種[2]。

動物線粒體基因組(mtDNA)具有進化速率快、多態(tài)性豐富、無重組等特點，被廣泛應用于動物起源、演化和分類，以及群體遺傳結構、親緣關系等研究[3]。由于野牦牛分布區(qū)生態(tài)環(huán)境惡劣，交通不便，其樣品難于獲得，從分子水平上對野牦牛的研究很少，目前僅見幾篇文獻報道。王敏強等[4- 5]利用微衛(wèi)星標記對6頭野牦牛遺傳多樣性進行分析，表明野牦牛具有豐富的遺傳多樣性。Guo S C等[6]基于mtDNA D-loop區(qū)部分序列(636—637 bp)對13頭野牦牛和250頭家牦牛及GenBank中已發(fā)表的相應序列對牦牛的起源、馴化和遺傳多樣性等進行了分析，表明家、野牦牛均具有豐富的遺傳多樣性。馬志杰等[7]對6頭野牦牛線粒體DNA D-loop區(qū)全序列進行了測定和分析，揭示野牦牛群體具有豐富的遺傳多樣性。另一方面，牦牛在牛亞科物種中的分類學地位仍然存在爭議。為確定野牦牛線粒體基因組全序列結構，并在此基礎上探究野牦牛在牛亞科中的分類學地位，本研究對野牦牛mtDNA進行全序列測定和結構分析，并結合GenBank中家牦牛、普通牛、瘤牛、歐洲野牛的相應序列對其分類學地位進行研究，以期為進一步了解野牦牛的遺傳特性、起源、演化和分類以及野牦牛遺傳資源的保護與利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

青海省大通牦牛原種場從小捕獲而人工飼養(yǎng)的6頭健康成年野牦牛，頸靜脈采血15 mL，EDTA抗凝，低溫保存帶回實驗室，置于-80℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

本研究的所有實驗工作均在動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室(西南民族大學)完成。

(1)基因組DNA提取和檢測

按照常規(guī)的酚-氯仿法提取野牦牛血液基因組DNA[8]，用紫外分光光度計和凝膠電泳雙重檢測其濃度和純度，調(diào)整終濃度到50—100 ng/μL備用。

(2)引物設計、合成

根據(jù)Guo等[6]報道的家牦牛mtDNA全序列(GenBank accession No.: AY684273)，綜合使用Primer Premier 5.0和oligo 6.0軟件設計特異性引物(表1)，引物序列由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。

(3)PCR擴增

PCR擴增體(25 μL)：10×ExTaqBuffer(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物分別為(20 pmol/L)1 μL，模板DNA(25—50 ng/μL)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.5 μL，超純水15.5 μL。10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(2.5 mmol/L)、Ex Taq酶(5 U/μL)等均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

PCR反應程序：95℃預變性4 min；95℃變性45 s，退火溫度根據(jù)片斷的Tm值而定退火時間為50 s，72℃延伸時間根據(jù)片斷的長短每1 kb/min設置，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 野牦牛全mtDNA基因組序列擴增引物及產(chǎn)物大小Table 1 MtDNA genome amplification primers and the product of the size in wild yak

(4)克隆、測序

對野牦牛mtDNA基因組PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，回收的目的片段進行連接、轉(zhuǎn)化，將構建的重組質(zhì)粒通過PCR法轉(zhuǎn)化子鑒定，以確保克隆成功。將純化后的陽性重組質(zhì)粒用3730 XL型全自動DNA測序儀進行測序，測序結果用Clustalw和DNASTAR軟件包中的MegAlign程序?qū)ν葱蛄羞M行排列，并經(jīng)人工仔細核查，通過Seqman進行拼接得到目的序列。

(5)生物信息學分析

首先利用Clustal X、Sequin和BLAST軟件對mtDNA全長序列進行同源序列比對分析，確定各蛋白編碼基因、rRNA基因及D-loop區(qū)在線粒體全基因組中的位置。用tRNAscan-SE在線分析軟件對tRNA進行預測，得到其2個tRNA基因。tRNAscan-SE沒有發(fā)現(xiàn)的tRNA基因通過與已知的牦牛(AY684273)序列比對確定，用RNAStructure和RNADraw軟件繪制其二級結構圖。

(6)系統(tǒng)進化樹的構建

從GenBank中搜索下載牛亞科其它物種的mtDNA全序列(表2)，用DNASTAR軟件包中的MegAlign程序?qū)⑵渑c本研究中測定的野牦牛相應序列進行多序列比對，后用DnaSP 4.50.3和MEGA 5.0計算不同序列間的變異位點、簡約信息位點數(shù)、顛換百分比、轉(zhuǎn)換/顛換比率、序列間的遺傳距離和差異百分比；分別用鄰位相連法NJ、最小進化法ME和最大簡約法MP作系統(tǒng)進化樹。

表2 牛亞科物種的線粒體全基因組序列來源Table 2 Information regarding samples for phylogenetic reconstruction

*為本次試驗所測序列

2 結果與分析

2.1 野牦牛線粒體基因組的結構特征

野牦牛線粒體基因組全長為16 322 bp，介于美洲野牛(Americanbison, NC_012346)16 319 bp和普通牛(Bostaurus, NC_006853)16 338 bp之間。共有37個基因，包括2個rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA，長度2 528 bp)、22個tRNA基因(長度為1 524 bp)、13個編碼蛋白基因(Protein-codinggenes, PCGs，長度為11420 bp)，非編碼D-loop區(qū)，序列長度為892 bp；分別位于L鏈和H鏈(圖1,表3)。基因組中無間隔序列，基因間排列緊密，無內(nèi)含子，37個基因間共存在69 bp重疊，長度從1—40 bp不等，其中ATPase8和ATPase6重疊40個堿基，是最長的重疊。

圖1 野牦牛線粒體基因組物理圖譜Fig.1 Structure of mammalian mitochondrial genome

表3 野牦牛線粒體基因組特征Table 3 Characteristics of mitochondrial genome in wild yak

野牦牛線粒體基因組序列的GC含量為38%，AT含量為62%。tRNA基因和蛋白編碼基因的GC含量存在差異，其中22個tRNA基因GC含量變化范圍在21.74%—46.38%，蛋白編碼基因GC含量的變化范圍在28.86%—44.81%，蛋白編碼基因的GC含量較tRNA基因高。ATPase8基因GC含量為28.86%，ATPase6基因GC含量為38.03%，兩者相差約9%。

牛亞科物種的線粒體基因組中堿基組成相對穩(wěn)定，野牦牛以及家牦牛、瘤牛、普通牛、綿羊、羚羊、鬣羊、水牛、美洲野牛、白犀牛、印度犀牛、馬的全基因組中A、C、G、T的比例分別為32.2%—33.7%、25.9%—28.5%、12.7%—14.0%、25.7%—27.4%；rRNA基因中，A、C、G、T的比例分別為36.7%—38.1%、22.2%—23.0%、15.9%—17.9%、22.7%—23.8%；tRNA基因中，A、C、G、T的比例分別為34.5%—35.7%、20.8%—22.4%、14.8%—15.5%、27.2%—29.0%；編碼蛋白基因中，A、C、G、T的比例分別為31.3%—32.8%、27.3%—30.4%、11.5%—12.8%、26.1%—28.0%；D-loop區(qū)中，A、C、G、T的比例分別為27.3%—33.7%、22.7%—30.9%、11.9%—15.5%、25.4%—29.8%。

野牦牛mtDNA組成偏好于堿基A和T，A+T含量遠高于C+G的含量，這與其他物種相似，表明哺乳動物線粒體基因組的結構相對保守，不僅表現(xiàn)在其堿基序列長度相似，且其4種堿基組成比例也十分相近，在D-loop區(qū)中長度差異大，有較多插入和缺失序列，其堿基組成比例也與其它分子標準變異相對較大，但總體堿基組成相對穩(wěn)定。

2.2 野牦牛線粒體蛋白質(zhì)編碼基因、tRNAs和密碼子使用頻率

野牦牛線粒體基因組有13個蛋白編碼基因，包含1個細胞色素b(Cytochromeb)編碼基因、2個ATP合成酶亞基(ATPase6和ATPase8)、3個細胞色素氧化酶亞基(COI、COII、COIII)和7個NADH脫氫酶亞基(ND- 1、- 2、- 3、- 4、- 4L、- 5、和 - 6)。這些蛋白編碼基因沒有內(nèi)含子，基因結構排列緊密，總長11420bp，占基因組全長的70%。除ND6基因之外的所有12個蛋白編碼基因全部由H鏈編碼。野牦牛線粒體基因組密碼子使用情況與已公布的?？破渌锓N基本一致：10個蛋白編碼基因起始密碼子均為ATG，僅ND2、ND3和ND5基因起始密碼子為非典型的ATA，終止密碼子使用最多的是TAA(10個)，ND2基因終止密碼子為TAG，COIII基因終止密碼子為ATA，Cytb基因終止密碼子為AGA。

野牦牛線粒體基因組含有22個tRNA，其中14種位于重鏈上，8種位于輕鏈上，基因長度為60—75 bp。其中包含2個tRNA-Leu(UUR和CUN)和2個tRNA-Ser(UCN和AGY)。采用軟件RNAscan-SE和RNAstructure預測tRNA二級結構發(fā)現(xiàn)，在22種tRNA基因中只有tRNA-Ser缺少二氫尿嘧啶環(huán)，其他的均可以折疊成典型的tRNA三葉草結構(圖2)，其中tRNA-Val二級結構包括：典型三葉草型，主要包括氨基酸接受臂(Acceptor stem)、反密碼子臂、反密碼子環(huán)(Anti-codon loop)、雙氫尿嘧啶(DHU)臂、TΨC臂、TΨC環(huán)(TΨCloop)。tRNA-Ser(AGY)的二級結構：缺乏雙氫尿嘧啶(DHU)臂。

圖2 野牦牛線粒體基因組tRNA的二級結構圖Fig.2 Secondary structure of tRNA in wild yak

為評估密碼子使用情況，計算了RSCU值(表4)。在線粒體全基因組序列中，UUA、CUA、AUA、GUU、UCU等30個密碼子的RSCU均大于1，為野牦牛線粒體基因組偏好性密碼子；其中A3s、T3s、C3s、G3s (A、T、G、C 的含量在第3位堿基總量中所占的比率) 分別42.38%、32.50%、32.99%、17.37%，A3s均大于T3s、C3s、G3s，表明野牦牛線粒體基因組偏愛使用堿基A或以A結尾的密碼子。

2.3 野牦牛與牛亞科其他物種間的系統(tǒng)進化關系

以野牦牛和牛亞科其他物種的線粒體全基因組為分子標準，分別用鄰位相連法NJ和最小進化法ME(圖3)和最大簡約法MP(圖4)構建系統(tǒng)進化樹。結果表明整個進化樹的置信度很高，各分支的支持率均為100。3種不同方法構建的分子系統(tǒng)進化樹基本一致，野牦牛是家牦牛的近緣野生種，親緣關系較近兩者首先相聚，形態(tài)學研究顯示牦牛的前額骨、上額骨和鼻骨在組織排列上與美洲野牛和歐洲野牛相似，分子生物學等研究也表明牦牛與美洲野牛親緣關系相近，再與美洲野牛聚為一類；普通牛與瘤牛聚為一類后與該類聚成一大類，其后與水牛相聚。最后才分別與其他物種相聚。

終止密碼子及Trp和Met(RSCU值為1)未列入表中

圖3 基于線粒體全基因組序列采用鄰接(NJ)和最小進化(ME)法圖構建的聚類關系Fig.3 Based on mtDNA sequence constructed the NJ and ME phylogenetic trees

圖4 基于線粒體全基因組序列采用最大簡約(MP)法圖構建的聚類關系Fig.4 Based on mtDNA sequence constructed the MP phylogenetic trees

3 討論

3.1 關于野牦牛線粒體基因組的結構特征

哺乳動物線粒體全基因組大小相對穩(wěn)定，全長均在16—17.5 kb間，只有極少數(shù)物種少于16 kb?；蚪M中無間隔序列，排列緊密，無內(nèi)含子，基因的排列順序基本一致。2個rRNA序列長度在2.5 kb左右、22個tRNA序列長度在1.5 kb左右，其序列長度和組成都比較接近[9]。長度最接近的是連接在一起的13個編碼蛋白序列，其序列長度穩(wěn)定在11.3 kb左右，且通過Clustalw的多序列比對，其堿基組成也十分相似，是很好的分子標準。長度差異最大的是D-loop區(qū)，其序列長度在800bp—1.7 kb，有較多的插入和缺失，可以看出線粒體基因組序列的長度差異主要存在于調(diào)控區(qū)。這些特點也表明線粒體基因組的穩(wěn)定性。

本研究中，野牦牛線粒體基因組全長為16 322 bp?；蚪M中無間隔序列，基因間排列緊密，基因內(nèi)無內(nèi)含子。整個基因組由37個編碼基因(2個rRNA基因、22個tRNA基因、13個編碼蛋白基因)和D-loop區(qū)組成。野牦牛線粒體基因組的組成、結構與其他哺乳動物的一致。

3.2 關于野牦牛的遺傳多樣性

自20世紀50年代以來，國內(nèi)外學者從不同的研究層次對牦牛的遺傳多樣性進行了較為深入的探討，揭示了家牦牛在群體內(nèi)和群體間均具有豐富的遺傳多樣性。但對野牦牛的遺傳多樣性，由于其性情粗野不易捕獲，且受分布范圍和數(shù)量等因素限制，至今尚未進行系統(tǒng)地分析研究。在本研究中，將野牦牛的線粒體基因組序列與家牦牛的序列(Accession No:AY684273)進行比對，以及對6頭野牦牛的mtDNA基因全序列進行SNP分析的結果均表明，野牦牛mtDNA基因序列內(nèi)具有較豐富的遺傳多態(tài)性，這與Guo[10]、張成福[11]、鐘金城[12]等對家牦牛線粒體DNA D-loop區(qū)序列的分析結果一致，表明野牦牛群體也具有較豐富的遺傳多樣性，這是今后開發(fā)利用牦牛遺傳資源和培育牦牛新品種的遺傳基礎。

3.3 關于牦牛的起源、演化及系統(tǒng)進化關系

據(jù)研究表明，現(xiàn)在的家養(yǎng)牦牛是距今五千多年前(龍山文化時期)，由我國古羌人在藏北羌塘等地區(qū)，將捕獲的野牦牛馴養(yǎng)而來的；在人類馴養(yǎng)的所有家畜中，唯獨牦牛的馴化史較清楚[13- 14]。現(xiàn)在的家養(yǎng)牦牛起源于我國的西藏；野牦牛是家養(yǎng)牦牛的近緣野生種。從目前發(fā)現(xiàn)的牦牛化石考證，野牦牛和家牦牛都是距今三百多萬年前(更新世)生存并廣為分布在歐亞大陸東北部的原始牦牛的后代。后來，由于地殼運動、氣候變遷而南移至現(xiàn)世界屋脊——我國青藏高原，并適應高寒氣候環(huán)境條件而延續(xù)下來，現(xiàn)今的家、野牦牛，都是同一祖先的后代，他們之間不存在祖先與后代的關系；現(xiàn)在的野牦牛，也不是家牦牛的始祖、始源或祖先的觀點[15]。

隨著分子生物學的興起和發(fā)展，利用現(xiàn)代分子技術輔以考古學、歷史學、形態(tài)學等對動物的馴化歷史進行了深入研究。近年來通過對野牦牛和家牦牛的研究初步揭示了牦牛的馴化歷史，群體間的遺傳多樣性及其結構等方面的內(nèi)容。Guo等[6,16]通過對250頭家牦牛及13頭野牦牛的D-loop部分序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個較大的母系遺傳分支，這兩個分支的分化時間約在131000—109000年以前，早于牦牛的馴化時間，同時顯示，在一個野生居群中也存在這兩大遺傳分支，表明所有的家養(yǎng)牦牛都起源于同一個野生基因庫。Ho等[17]基于D-loop片段對牦牛兩大分支的分化時間重新進行估計，結果顯示其分化時間在75000年以前。

關于牦牛的起源、演化和動物學分類地位，一直是牦牛科學研究的熱點之一。學者們依不同的研究方法和證據(jù)，提出了各自的觀點和看法。在《中國牛品種志》[18]、《中國畜禽遺傳資源志·牛志》[19]中，認為牦牛(Bosgrunniens)與普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicus)等均為牛屬(Bos)中的不同種，他們屬于種間的關系。而Gray[20]、Groves[21]、馮祚建[22]、Miyamoto[23]、Olsen[24- 25]、Geraads[26]、Kraus[27]、Wall[28]、Hassanin[29]、李齊發(fā)[30]、常洪[31]等學者分別從古生物學、形態(tài)學、分子生物學等的研究結果，認為牦牛與普通牛、瘤牛分屬于不同的屬，牦牛屬于牦牛屬(Poephagus)，牦牛屬包括家牦牛(Poephagusgrunniens)和野牦牛(Poephagusmutus)2個種，普通牛和瘤牛為家牛屬(Bos)。在本研究中，基于線粒體基因組的分子系統(tǒng)發(fā)生分析結果顯示野牦牛與家牦牛首先相聚在一起，然后再與美洲野牛聚為一類；普通牛與瘤牛聚為一類；這兩類相聚成一大類后，才與水牛聚為更大的一類，最后才分別與其他物種相聚。因此，將牦牛劃分為牛亞科中一個獨立屬——牦牛屬(Poephagus)較將牦牛作為牛屬中的一個亞屬或一個種更合適，牦牛屬包括家牦牛(Poephagusgrunniens) 和野牦牛(Poephagusmutus)2個不同的種。

4 結論

野牦牛線粒體基因組的組成、結構與其他哺乳動物的相似，基因組全長為16 322 bp，基因組中無間隔序列，基因間排列緊密，基因內(nèi)無內(nèi)含子；整個基因組由37個編碼基因(2個rRNA基因、22個tRNA基因、13個編碼蛋白基因)和D-loop區(qū)組成。野牦牛具有較豐富的遺傳多樣性。研究結果支持牦牛屬(Poephagus)為牛亞科中的一個獨立屬，包括家牦牛(Poephagusgrunniens)和野牦牛(Poephagusmutus)2個種。

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Mitochondrial complete genome sequencing and phylogenetic research on wild yak

ZHONG Jincheng1,*, CHAI Zhixin1, MA Zhijie2, WANG Yong1, YANG Wanyuan1, LA Huan3

1KeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding,SouthwestUniversityforNationalities,StateEthnicAffairsCommissionandMinistryofEducation,Chengdu610041,China2AcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicineofQinghaiUniversity,QinghaiPlateauYakResearchCenter,Xining810016,China3QinghaiDatongCattleFarm,Xining810102,China

Wild yak(Bos grunnients mutus), endemic Bovidae species in alpine region, is one of the most precious wild animal genetic resources in China. It has been listed as national protected animal. Our study analysed the whole sequence composition of mtDNA of wild yak and explored yak′s taxonomic status. The results showed that the size of complete Mitochondrial genome of wild yak is 16 322 bp that include 22 tRNA genes, 2 rRNA genes, 13 protein coding genes and one D-loop region. The length of two rRNA genes, 22 tRNA genes, 13 code-length protein sequences and D-loop were 2528 bp, 1524 bp, 11420 bp and 892 bp respectively. The sequence has the characterization of no interval sequence, and the gene order is close with no intron. Wild yak have abundant genetic diversity.The phylogenetic trees constructed with whole mitochondrial genome sequences of wild yak, domestic yak, Zebu cattle, Cattle, Sheep, Chiru, Aoudad, Water buffalo, American bison, White rhinoceros, Greater Indian rhinoceros and Horse showed that the wild yak and domestic yak clustered firstly, and then meet with the American bison, followed with zebu/cattle and water buffalo.The yak is a species of the subfamily—Poephagus, and the domestic yak(Poephagus grunniens) and wild yak(Poephagus mutus) are two different species in the yak. The study has the great theoretical and practical significance for yak′s origin, evolution and classification. At the same time, it is helpful to protection and utilization of wild yak genetic resources.

wild yak; mitochondria genome; phylogeny

國家科技支撐計劃課題(2012BAD13B06); 中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(11NZYTH03)

2013- 10- 14;

日期:2014- 07- 14

10.5846/stxb201310142481

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhongjincheng518@126.com

鐘金城, 柴志欣, 馬志杰, 王永, 楊萬遠, 拉環(huán).野牦牛線粒體基因組序列測定及其系統(tǒng)進化.生態(tài)學報,2015,35(5):1564- 1572.

Zhong J C, Chai Z X, Ma Z J, Wang Y, Yang W Y, La H.Mitochondrial complete genome sequencing and phylogenetic research on wild yak.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1564- 1572.