戚 琳，劉滿強(qiáng),2,*，蔣林惠，張楗嶠，李修強(qiáng)，陳法軍，胡 鋒

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095 2 中國科學(xué)院南京土壤研究所/土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210008 3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京 210095

基于根際與凋落物際評價轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤線蟲群落的影響

戚 琳1，劉滿強(qiáng)1,2,*，蔣林惠1，張楗嶠1，李修強(qiáng)1，陳法軍3，胡 鋒1

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095 2 中國科學(xué)院南京土壤研究所/土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210008 3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京 210095

轉(zhuǎn)基因作物在商業(yè)化推廣前，有必要評價其對非靶標(biāo)土壤生物的生態(tài)影響。根系和凋落物與土壤的界面是代表植物直接影響土壤的兩個典型活性微域，即根際和凋落物際?；谑覂?nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)構(gòu)建水稻根際和凋落物際，比較了這兩個高活性微域中轉(zhuǎn)Bt水稻克螟稻(KMD)與親本水稻秀水11(XSD)對土壤可利用資源、微生物學(xué)性質(zhì)和線蟲群落的影響。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤性質(zhì)的影響依賴于水稻生育期和微域的變化。與XSD相比，KMD在苗期和拔節(jié)期顯著提高了凋落物際土壤可溶性有機(jī)氮含量(P<0.05)；在苗期顯著降低了凋落物際土壤銨態(tài)氮含量，但在成熟期顯著提高了凋落物際與交互微域土壤的銨態(tài)氮含量(P<0.05)。與親本水稻相比，轉(zhuǎn)Bt水稻分別在苗期和成熟期顯著提高了凋落物際土壤微生物生物量碳和活性，而在拔節(jié)期和成熟期顯著降低了根際土壤微生物生物量氮含量(P<0.05)。微域間的交互作用顯著影響土壤微生物生物量、可溶性有機(jī)碳和氮、線蟲總數(shù)和各食性線蟲的數(shù)量(P<0.05)。轉(zhuǎn)Bt水稻總體上降低了土壤線蟲總數(shù)，尤其在苗期和拔節(jié)期的凋落物際土壤中達(dá)到顯著水平。重復(fù)測量方差分析表明轉(zhuǎn)Bt水稻顯著影響土壤食細(xì)菌(P<0.01)和食真菌(P<0.05)線蟲數(shù)量，及線蟲群落的通道指數(shù)和富集指數(shù)。水稻收獲后KMD秸稈的Bt蛋白含量顯著高于親本，全部KMD處理的土壤樣品中Bt蛋白含量無顯著變化，因而轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤生物學(xué)性質(zhì)的影響可能并非來源于Bt蛋白的作用，而更可能來自于水稻生長性狀和凋落物性質(zhì)的差異。

轉(zhuǎn)Bt水稻；根際；凋落物際；Bt蛋白；線蟲群落

水稻是我國主要的糧食作物之一，卻因長期遭受病蟲害的嚴(yán)重侵襲造成大量減產(chǎn)。傳統(tǒng)化學(xué)防治既會增加生產(chǎn)成本又會造成環(huán)境污染。轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲蛋白的表達(dá)能夠減少農(nóng)藥施用量，在我國糧食安全保障中具有重要的地位[1]。轉(zhuǎn)Bt水稻由于外源基因的插入，改變了作物組織的化學(xué)成分組成和生理生化性狀[2]，在生長期間可能影響農(nóng)田生物群落組成和多樣性。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)Bt水稻生態(tài)風(fēng)險評價的研究大多集中于地上部非靶標(biāo)生物[3- 5]，土壤食物網(wǎng)中處于較高營養(yǎng)級的土壤動物正逐漸受到關(guān)注[6- 10]。

線蟲是農(nóng)田土壤中多樣性較為豐富的優(yōu)勢生物類群[11]，在評價農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)方面具很大優(yōu)勢[12]。首先，線蟲可敏感地反映土壤環(huán)境的細(xì)微變化[13]；其次，線蟲食性多樣，在土壤食物網(wǎng)中扮演重要角色，對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)等功能起著重要作用，其營養(yǎng)類群結(jié)構(gòu)的改變與土壤生態(tài)系統(tǒng)過程緊密聯(lián)系[14]；且其分離、鑒定較為簡單[15]，有助于評價轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險。目前，利用線蟲群落研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響多集中在玉米[16- 18]和棉花[19]等作物上，研究結(jié)果各異。例如，Griffiths等[16]在3個不同試驗(yàn)地種植轉(zhuǎn)Bt及親本玉米，發(fā)現(xiàn)二者之間的土壤線蟲群落無顯著差異；而Mina等[19]發(fā)現(xiàn)幾乎全部采樣時期Bt棉花根際土壤的微型、中型和大型土壤動物數(shù)量均高于非Bt棉花根際土壤。以往的相關(guān)研究主要關(guān)注土體土壤[16- 17]，針對植物影響較為直接和強(qiáng)烈的微域土壤研究較少。以往的研究中，較多關(guān)注單一的根系生長或凋落物分解過程對土壤的影響，而綜合根際和凋落物際對土壤生物群落的影響鮮有報道[20]。

根際(根系-土壤界面)代表空間小尺度的高活性微域，受作物根系生長過程的直接影響而形成，對根際的研究有利于理解土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能[14]。凋落物際(凋落物-土壤界面)與凋落物直接接觸，受凋落物分解過程直接影響，對土壤有機(jī)碳的礦化貢獻(xiàn)很大[21]。二者都是資源豐富和生物活性極高的微域[22]，其養(yǎng)分狀況和生物群落結(jié)構(gòu)與土體土壤的大為不同[20]。轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤的影響主要通過作物根系生長和殘體分解兩個途徑，根際和凋落物際代表進(jìn)行這兩個途徑的微域。根際土壤生物與植物根系相互作用，對根際生態(tài)環(huán)境和生態(tài)功能、地上部群落具有強(qiáng)烈的影響[14]，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和土壤微生物的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[23]。鑒于根際和凋落物際是直接受到轉(zhuǎn)Bt水稻根系生長和凋落物分解影響的高活性微域，土壤線蟲群落在這兩個微域內(nèi)的響應(yīng)可能比土體土壤內(nèi)的響應(yīng)更靈敏，因此，綜合這兩個微域的線蟲群落分析可對評估轉(zhuǎn)Bt水稻的土壤生態(tài)風(fēng)險起到預(yù)警作用。

本文通過構(gòu)建水稻根系-土壤和凋落物-土壤的活性界面(即根際和凋落物際)，研究轉(zhuǎn)Bt水稻種植過程中不同生育期內(nèi)的根際和凋落物際的微生物學(xué)性質(zhì)和線蟲群落結(jié)構(gòu)的變化，以期深入評價轉(zhuǎn)Bt水稻短期種植后對不同微域中土壤生物群落的生態(tài)風(fēng)險影響。預(yù)期結(jié)果有助于構(gòu)建轉(zhuǎn)Bt水稻生態(tài)安全監(jiān)測指標(biāo)，全面了解轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用轉(zhuǎn)Bt水稻克螟稻及其非轉(zhuǎn)Bt親本秀水11。其中，轉(zhuǎn)Cry1Ab純合基因抗蟲恢復(fù)系克螟稻(簡稱克螟稻，KMD)是將Bt(Bacillusthuriengsis)殺蟲蛋白基因(Cry1Ab)導(dǎo)入晚粳稻秀水11(簡稱秀水稻，XSD)后選育出的Bt水稻，對8種鱗翅目害蟲具有高抗性，稻種由浙江大學(xué)原子能研究所提供。

供試土壤采自江西鷹潭余江縣長期耕作的雙季稻稻田，屬于河流沖積土發(fā)育而成的潴育型水稻土，耕層土壤(0—15 cm)有機(jī)質(zhì)含量25.5 g/kg，全氮1.54 g/kg，有效氮95.1 mg/kg，有效磷16.1 mg/kg，速效鉀34.2 mg/kg，pH值 5.5。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 盆缽內(nèi)構(gòu)建凋落物際和根際的凋落物網(wǎng)袋及水稻根系分布示意圖Fig.1 Schematic view of detritusphere and rhizosphere set-up via the spatial layout of litter mesh bags and roots of rice plants in the pots

水稻種植盆缽選用高19 cm，直徑17 cm的圓形塑料桶，將兩個品種的水稻凋落物(即水稻收獲后的地上部秸稈，包含莖桿和葉片)分別烘干研磨，稱取50 g凋落物與50 g鮮土混勻后裝入孔徑2 mm的網(wǎng)袋中。網(wǎng)袋平整地壓實(shí)，豎直擺放在桶的直徑剖面上(圖1)，周圍填滿土，每個盆缽裝土5 kg。網(wǎng)袋中凋落物與種植的水稻品種一致，此網(wǎng)袋邊際為凋落物際的采樣點(diǎn)。不添加凋落物際的處理中，網(wǎng)袋中僅裝50 g鮮土。水稻種子在30% H2O2溶液中浸種30 min后再用大量清水反復(fù)沖洗。在去離子水中避光浸泡24 h后平鋪在濕潤紗布上室溫避光培養(yǎng)，2—3 d種子出芽，5 d后移栽長勢健壯一致的水稻幼苗。

于2011年6月1日移栽水稻幼苗，創(chuàng)建3種微域：① 不種植水稻，土壤中僅添加凋落物(D，凋落物際)；② 種植水稻，土壤中不添加凋落物(R，根際)；③種植水稻，土壤中添加對應(yīng)品種的凋落物(DR，復(fù)合微域，即包含凋落物際和根際的復(fù)合影響)，每個處理設(shè)4重復(fù)。每桶分別種植8株轉(zhuǎn)Bt或其非轉(zhuǎn)Bt親本水稻，水稻與凋落物袋的距離為2 cm，播種前基肥施入量為脲 1.0 g、NH4H2PO40.5 g、KCl 0.5 g(相當(dāng)于田間施肥水平：N 150 kg/hm2，P 75 kg/hm2，K 150 kg/hm2)，并于拔節(jié)期同水平追肥一次，盆缽置于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室中，日常管理保持土壤水分飽和。隨著水稻根系的生長，根系逐漸插伸在網(wǎng)袋中形成了與密集的“根系網(wǎng)”，因此在沒有凋落物的盆缽中形成根際。同樣，沒有種植水稻的盆缽中，網(wǎng)袋內(nèi)凋落物分解過程中形成了凋落物際，而在同時種植水稻和含有凋落物袋的盆缽中形成了受到根系和凋落物共同影響的復(fù)合微域。分別在7月13日(苗期)、9月3日(拔節(jié)期)和10月28日(成熟期)用內(nèi)徑2 cm的土鉆緊貼凋落物網(wǎng)袋采集土壤樣品，每次采樣用標(biāo)簽記錄，以便不干擾下次采樣。在水稻成熟期收獲水稻地上部植株鮮樣并保存在-70 ℃冰箱，用于測定Cry1Ab蛋白含量。挑出土壤中的植物殘體后放入4 ℃冰箱保存，盡快進(jìn)行土壤微生物學(xué)性質(zhì)、線蟲群落分析和速效養(yǎng)分的測定。

1.2.2 測定方法

Bt蛋白含量的測定采用美國Agdia公司生產(chǎn)的Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)Bt-CrylAb酶聯(lián)免疫試劑盒。試劑盒每個孔中加入100 μL酶連接液，在酶標(biāo)板的前兩列中加入8個不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 ng/mL)的Bt標(biāo)準(zhǔn)蛋白，秸稈樣品稀釋液以及土壤樣品上清液按順序分別加入板中，將酶標(biāo)板放入鋪有濕紙巾的密閉容器中，室溫孵育2 h后洗板并加入TMB顯色底物和3 mol/L的H2SO4作為反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm下讀數(shù)，測定酶標(biāo)板中每個測試孔的光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出Cry1Ac/Ab殺蟲蛋白的含量，換算成ng/g鮮重來表示。

可溶性有機(jī)碳和氮采用0.5 mol/L K2SO4溶液浸提，8000 r/min離心10 min后上清液過孔徑0.45 μm的醋酸纖維濾膜，濾液中碳氮含量測定分別用K2Cr2O4外加熱法和半微量凱氏定氮法測定。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用2 mol/L KCl溶液浸提，充分震蕩后過濾取濾液用連續(xù)流動分析儀(Auto Analyzer Ⅲ，Bran and Luebbe, Germany)進(jìn)行測定。

用氯仿熏蒸-K2SO4溶液浸提法測定新鮮土樣的微生物生物量碳和氮，熏蒸土樣與未熏蒸土樣的有機(jī)碳和氮差值的轉(zhuǎn)換系數(shù)分別是KC=0.38，KN=0.54[24]。土壤基礎(chǔ)呼吸采用呼吸瓶22℃黑暗培養(yǎng)3 h，收集氣體樣品用氣象色譜分析(Agilent 7890A, USA)。微生物代謝熵為土壤基礎(chǔ)呼吸與微生物生物量碳的比值。采用蔗糖浮選離心法分離線蟲[25]，在立體顯微鏡下直接計(jì)數(shù)并換算成100 g干土的線蟲數(shù)量。在生物顯微鏡下進(jìn)行線蟲屬種鑒定，根據(jù)線蟲的頭部形態(tài)學(xué)特征和取食習(xí)性劃分為植食、食細(xì)菌、食真菌和捕食/雜食線蟲[26]。

自由生活線蟲成熟度指數(shù)：

MI=∑vi×fi

式中，vi為自由生活線蟲的c-p值，fi為某科/屬(i)在自由生活線蟲(不包括植食線蟲)總數(shù)中所占的比重。

線蟲通道指數(shù)NCR為食細(xì)菌線蟲與食微線蟲(食細(xì)菌+食真菌)數(shù)量之比。

Shannon多樣性指數(shù)：

H′=-∑PilnPi

式中,Pi為第i個分類單元中個體占線蟲總數(shù)的比例。

富集指數(shù)：

EI=100×(e/(e+b))

結(jié)構(gòu)指數(shù)：

SI=100×(s/(b+s))式中,e為食物網(wǎng)中的富集成分，主要指食細(xì)菌線蟲中c-p值為1和食真菌線蟲中c-p值為2的類群，b為食物網(wǎng)中的基礎(chǔ)成分，主要指食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲中c-p值為2的類群，s為食物網(wǎng)中的結(jié)構(gòu)成分群，分別為食細(xì)菌線蟲、食真菌線蟲和捕食/雜食線蟲中c-p值為3—5的類群以及捕食性線蟲中c-p值為2—5的類群[27]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用重復(fù)測量方差分析法(ANOVA)分析不同采樣時期KMD和XSD種植條件下土壤微生物學(xué)性質(zhì)、線蟲群落和養(yǎng)分的變化。同一采樣時間同種微域土壤的KMD和XSD之間的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同微域、相同水稻品種之間的差異比較采用最小顯著極差法(LSD)，顯著性水平設(shè)α=0.05。

KMD和XSD種植下線蟲群落結(jié)構(gòu)的差異采用非度量多變量排序(nMDS)，用以檢驗(yàn)各采樣時期不同水稻品種的微域土壤線蟲群落組成的總體變化。上述分析方法基于各線蟲屬相對豐度的Bray-Curtis相似性矩陣，所有分析采用SPSS 16.0和PRIMER 5.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Bt水稻及親本對土壤養(yǎng)分、Bt蛋白含量及微生物學(xué)性質(zhì)的影響

表1 轉(zhuǎn)Bt水稻及親本對不同微域土壤Bt蛋白、有效養(yǎng)分含量和微生物學(xué)性質(zhì)影響的重復(fù)測量方差分析結(jié)果

Table 1 Repeated-measure ANOVA results for the effects of different rice varieties (transgenicBtand non-Btlines) and microsites on soilBtprotein, available nutrients content and microbial properties

效應(yīng)Effect自由度df可溶性碳DOC可溶性氮DON銨態(tài)氮NH+4-N硝態(tài)氮NO-3-NBt蛋白Btprotein微生物量碳MBC微生物量氮MBN基礎(chǔ)呼吸BR微生物代謝熵qCO2微域(M)Microsite27.01**38.7**4.65*2.091.3520.12**8.15**1.8715.29**水稻品種(V)Variety10.1810.43**0.006.08*8.82**9.32**2.150.018.28**M×V20.795.40*5.03*1.080.190.404.25*0.310.06error18采樣時間(T)Time25.06*434.42**22.91**52.92**3.6*185.03**76.45**238.94**343.44**T×M44.55**16.48**0.370.430.3226.61**2.66*7.81**12.91**T×V20.267.58**5.32**0.441.112.950.343.37*6.75**T×M×V40.702.822.591.660.050.750.771.621.00error36

DOC: Dissolved organic carbon;DON: Dissolved organic nitrogen;MBC: Microbial biomass carbon;MBN: Microbial biomass nitrogen;BR: Basal respiration;qCO2: Microbial metabolic quotient;*表示差異顯著; **表示差異極顯著

圖2 轉(zhuǎn)Bt水稻(KMD)及親本(XSD)對不同微域土壤可溶性養(yǎng)分含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.2 Effects of transgenic Bt and non-Bt rice varieties on soil dissolved nutrients contents (mean±SE)

所有采樣時期各微域KMD土壤樣品中均能檢測到Bt蛋白，但含量很低，土壤Bt蛋白含量在0.105—0.108 ng/g范圍內(nèi)，最小值和最大值分別出現(xiàn)在水稻苗期和成熟期的根際土壤，且不同微域土壤間的Bt蛋白含量無顯著差異(圖3)。水稻成熟期收獲的水稻植株中，KMD秸稈Bt蛋白含量顯著高于親本，根際和交互微域處理的同一品種的水稻秸稈中Bt蛋白含量無顯著差異(P>0.05，圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)Bt水稻(KMD)不同微域土壤Bt蛋白及成熟期轉(zhuǎn)Bt水稻(KMD)、親本水稻(XSD)秸稈Bt蛋白含量Fig.3 Contents of soil Bt protein of transgenic Bt and non-Bt rice varieties and Bt protein content in straw after maturing stage (mean±SE)

相比于親本，轉(zhuǎn)Bt水稻總體上提高了土壤MBC，僅在成熟期D土壤中KMD比XSD降低了MBC，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，KMD顯著提高了苗期D土壤MBC；轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤MBN的影響因水稻生長期和微域而異，3個時期KMD比XSD降低了R土壤MBN，在拔節(jié)期和成熟期達(dá)到顯著水平(P<0.05)，成熟期D土壤BR顯著提高(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)Bt水稻(KMD)及親本(XSD)對不同微域土壤微生物生物學(xué)性質(zhì)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.4 Effects of transgenic Bt and non-Bt rice varieties on soil microbial properties (mean±SE)

2.2 轉(zhuǎn)Bt水稻及親本對土壤線蟲數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤線蟲總數(shù)受微域和轉(zhuǎn)Bt水稻品種及其交互作用影響顯著；其中，食微線蟲(食細(xì)菌和食真菌線蟲)數(shù)量受水稻品種影響顯著，自由生活線蟲(食微線蟲+捕食/雜食線蟲)受微域及水稻生長期影響顯著(P<0.05)，微域間的交互作用對土壤線蟲數(shù)量和各食性線蟲數(shù)量影響顯著。線蟲通道指數(shù)(NCR)和富集指數(shù)(EI)受微域和水稻品種的顯著影響，而水稻品種對成熟度指數(shù)(MI)影響顯著，微域間的交互作用對MI、NCR、EI和SI的影響達(dá)到顯著水平(表2)。

表2 轉(zhuǎn)Bt水稻及親本在不同微域下線蟲數(shù)量及生態(tài)指標(biāo)的重復(fù)測量方差分析結(jié)果

Table 2 Repeated-measure ANOVA results for the effects of different rice varieties (transgenicBtand non-Btlines) and microsites on soil nematode abundance and ecological indices

效應(yīng)Effect自由度df線蟲總數(shù)Nematodeabundance植食線蟲PF食細(xì)菌線蟲BF食真菌線蟲FF捕食/雜食線蟲O&C成熟度指數(shù)MI多樣性指數(shù)H'通道指數(shù)NCR富集指數(shù)EI結(jié)構(gòu)指數(shù)SI微域(M)Microsite228.72**0.4220.26**4.73*19.35**1.974.3*6.11**8.85**1.65水稻品種(V)Variety18.64**1.8836.33**5.66*1.6812.08**3.079.61**6.32*0.41M×V24.00*4.94*8.01**6.95**1.716.88**2.340.342.901.72error18采樣時間(T)Time233.32**0.6569.79**3.69*33.7**78.20**64.88**14.11**29.24**2.96T×M415.56**2.74*16.93**3.81*12.56**9.96**1.784.48**3.55*4.51**T×V20.612.1917.63**4.02*1.9411.87**1.031.931.791.39T×M×V40.500.145.05**3.22*1.533.89**1.030.991.040.41error36

PF: Plant feeders; BF: Bacterial feeders; FF: Fungal feeders; O&C: Omnivorous & Carnivorous;MI: Maturity index;H′: Shannon-Wiener index;NCR: Nematode channel ratio;EI: Enrichment index;SI: Structure index; *P<0.05, **P<0.01

圖5 轉(zhuǎn)Bt水稻(KMD)及親本(XSD)對不同微域土壤線蟲總數(shù)和營養(yǎng)類群結(jié)構(gòu)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.5 Effects of transgenic Bt and non-Bt rice varieties on soil nematode abundance and trophic groups (mean±SE)

轉(zhuǎn)Bt水稻的種植增加了拔節(jié)期和成熟期R土壤的線蟲數(shù)量，但增量很小，在其他處理中線蟲數(shù)量均降低，并在苗期和拔節(jié)期的D土壤中達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖5)。在苗期和拔節(jié)期D土壤中KMD顯著降低了食微線蟲比例，在拔節(jié)期R土壤中顯著增加了植食線蟲比例。

非度量多變量排序(nMDS)結(jié)果表明，整個水稻生育期內(nèi)、不同微域土壤中轉(zhuǎn)Bt水稻與親本相比線蟲群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(圖6)，D和R土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)在3次采樣時間下區(qū)分明顯，說明D和R微域中采樣時間對線蟲群落結(jié)構(gòu)的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05，圖6a,b)；拔節(jié)期和成熟期的根際-凋落物際(DR)土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)區(qū)分不明顯(圖6c)。而在苗期和拔節(jié)期，R處理與其他兩處理差異顯著，D和DR土壤中XSD和KMD區(qū)分明顯(圖6d,e)；水稻成熟期時，D處理與其他兩處理差異顯著(圖6f)。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)Bt水稻對不同微域土壤Bt蛋白及可利用資源的影響

Bt殺蟲蛋白在土壤中能否長期殘留取決于Bt蛋白含量的釋放量、微生物降解速率和非生物的鈍化速率等[28- 29]，一些研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt水稻殺蟲蛋白不會在土壤中積累[30- 31]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水稻苗期和拔節(jié)期，KMD的凋落物際和交互微域土壤中Bt蛋白含量高于根際。這可能是由于水稻生長前期土壤中凋落物迅速分解，向土壤中釋放了少量的Bt蛋白[32]。而3個采樣時期KMD全部微域土壤之間的Bt蛋白含量無顯著差異，認(rèn)為種植轉(zhuǎn)Bt水稻并不會造成土壤Bt蛋白含量的增加。轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻秸稈還田后只要經(jīng)一定時間的充分降解，秸稈中的Bt蛋白一般不會在土壤中形成明顯的殘留[33- 34]。Saxena等[35]認(rèn)為Bt蛋白的殘留視作物類型而定，一些抗蟲作物(如玉米、馬鈴薯等)通過根系分泌使土壤中有Cry蛋白，而Bt棉花、油菜和煙草卻沒有。

圖6 不同微域(a, b, c)和采樣時間(d, e, f)條件下土壤線蟲群落的非參數(shù)多變量排序圖Fig.6 Non-metric multidimensional scaling ordination of soil nematode community structure under different microsites (a,b,c) and sampling dates (d,e,f)

本研究發(fā)現(xiàn)土壤可溶性有機(jī)碳含量僅受到微域和采樣時間的顯著影響，而非水稻品種的影響。有機(jī)物與土壤的界面往往含有更高的來自凋落物和根系的可溶性碳氮資源[36- 37]。李修強(qiáng)等[38]通過連續(xù)兩年田間種植也沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤可溶性有機(jī)碳和氮產(chǎn)生持續(xù)的顯著影響，而采樣時間對其影響顯著，玉米的研究中也得到相同的結(jié)論[39- 40]。土壤礦質(zhì)氮受采樣時間影響顯著，說明隨著水稻根系的生長，根際的效應(yīng)逐漸強(qiáng)化，對土壤礦質(zhì)氮的作用不斷加強(qiáng)。轉(zhuǎn)Bt水稻相比于親本對土壤礦質(zhì)氮的影響因微域的不同而變化，推測由于水稻苗期根系不發(fā)達(dá)，且網(wǎng)袋內(nèi)的凋落物迅速分解，到了成熟期水稻根系旺盛、凋落物分解漸緩，這兩個過程交互作用影響土壤礦質(zhì)氮的變化。劉玲等[41]發(fā)現(xiàn)種植轉(zhuǎn)Bt玉米2個月左右后，根際土壤銨態(tài)氮含量較親本玉米顯著降低，硝態(tài)氮含量與親本無顯著差異。

3.2 轉(zhuǎn)Bt水稻對不同微域土壤微生物學(xué)性質(zhì)的影響

土壤微生物生物量碳能夠快速反映土壤有機(jī)碳的數(shù)量和質(zhì)量變化[42]。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)Bt水稻顯著提高了苗期凋落物際土壤微生物生物量碳，而在水稻拔節(jié)期和成熟期顯著降低了根際土壤微生物生物量氮，可能是由于添加的轉(zhuǎn)Bt和親本水稻凋落物在有機(jī)物組成上的差異所致[20]；上述結(jié)果也暗示轉(zhuǎn)Bt水稻種植后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可能也發(fā)生了變化。李修強(qiáng)等[38]通過大田實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比各自的親本，克螟稻和華恢1號顯著降低了苗期土壤MBC，而Bt汕優(yōu)稻則效果相反；戚琳等[43]通過1a的田間實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)基因水稻品種對土壤微生物量的影響不同，種植HH1比親本水稻MH63顯著增加了土壤微生物生物量碳含量，而種植另外兩種轉(zhuǎn)Bt水稻T2A- 1和T1C- 19與親本相比沒有差異；3種轉(zhuǎn)Bt水稻種植后與親本相比對土壤微生物生物量氮含量沒有影響；而萬小羽等[44]和Sarkar等[45]均研究發(fā)現(xiàn)Bt棉花的根際土壤微生物生物量碳顯著高于對照。這些研究結(jié)果間的分歧說明土壤生物受到的影響因素非常復(fù)雜，尚不能確定是Bt蛋白的影響。

種植轉(zhuǎn)Bt水稻與親本水稻對土壤基礎(chǔ)呼吸無顯著影響，在其他植物(如玉米)上也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[39- 45, 46]。但也有研究得出相反的結(jié)論，李修強(qiáng)等[38]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt水稻與各自親本相比，對土壤基礎(chǔ)呼吸的影響達(dá)到顯著水平。本研究發(fā)現(xiàn)土壤中添加轉(zhuǎn)Bt水稻凋落物后，成熟期凋落物際土壤基礎(chǔ)呼吸與親本凋落物際存在顯著差異。這是因?yàn)榈蚵湮锸峭寥郎锟衫梦镔|(zhì)和能量的主要來源，添加的轉(zhuǎn)Bt和親本水稻凋落物在有機(jī)物組成不同，對凋落物際的微生物群落活性產(chǎn)生了不同的影響。土壤微生物代謝熵(qCO2)為土壤微生物呼吸釋放的CO2-C量與土壤微生物生物量碳的比值，其值的變化能夠反映土壤有機(jī)碳源的生物有效性或者微生物對有機(jī)碳的利用效率。土壤微生物代謝熵顯著受到水稻品種的影響，但各采樣時間內(nèi)，轉(zhuǎn)Bt水稻對其影響不顯著，說明轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤有機(jī)碳生物有效性及微生物碳源利用效率的影響主要依賴于水稻生長期和微域類型。

3.3 轉(zhuǎn)Bt水稻對不同微域土壤線蟲群落的影響

本研究發(fā)現(xiàn)苗期交互微域土壤線蟲總數(shù)顯著高于根際土壤，說明土壤中添加水稻凋落物顯著提高了苗期土壤線蟲總數(shù)，而在拔節(jié)期和成熟期，根際和交互微域土壤間各個水稻品種下線蟲總數(shù)無顯著差異，與微生物學(xué)性質(zhì)變化的原因基本一致，推測在水稻成熟期由于凋落物處于分解的后期，凋落物際作用的弱化導(dǎo)致兩個處理間的差異逐漸消失[47- 48]。轉(zhuǎn)Bt水稻短期內(nèi)對食微線蟲和植食線蟲的數(shù)量產(chǎn)生了顯著的影響，由于微域土壤內(nèi)Bt蛋白含量的差異不明顯，上述結(jié)果更可能是由于轉(zhuǎn)Bt作物外源基因的插入導(dǎo)致根系分泌物成分發(fā)生變化，或作物生理生化性狀改變了土壤中化學(xué)物質(zhì)的比例，進(jìn)而影響線蟲群落的數(shù)量和組成[28]。轉(zhuǎn)Bt作物對土壤線蟲影響的研究有諸多不同結(jié)果，Griffiths等[16]發(fā)現(xiàn)在3個不同地點(diǎn)大田種植Bt玉米與非Bt玉米相比，線蟲數(shù)量表現(xiàn)出顯著而短暫的降低趨勢，而溫室實(shí)驗(yàn)結(jié)論相反[49]。戚琳等[43]發(fā)現(xiàn)田間種植轉(zhuǎn)Bt與非Bt水稻，二者土壤線蟲總數(shù)無顯著差異，植食線蟲和捕食/雜食線蟲的比例增加。李修強(qiáng)等[8]發(fā)現(xiàn)各采樣時期BtSY63和SY63土壤線蟲數(shù)量差異均未達(dá)到顯著水平，而線蟲群落的Shannon多樣性指數(shù)、線蟲通道指數(shù)和成熟度指數(shù)均受采樣時間影響顯著。此外，不同作物種類、土壤類型、氣候條件和土樣采集方式對土壤線蟲群落也存在影響，今后仍需長期定位實(shí)驗(yàn)才能更全面系統(tǒng)地評價轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤非靶標(biāo)生物的影響。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)Bt水稻對線蟲群落結(jié)構(gòu)的影響依賴于水稻生育期和微域的差異，土壤有效資源、微生物學(xué)性質(zhì)和線蟲總數(shù)及群落結(jié)構(gòu)受到的顯著影響更主要是來源于微域及微域間的交互作用。伴隨水稻的生長及分解進(jìn)程，根際的作用逐漸加強(qiáng)，而凋落物際的作用減弱。這兩個過程共同影響微域內(nèi)土壤生物群落的數(shù)量和活性。轉(zhuǎn)Bt水稻與親本相比，對根際土壤微生物生物量氮、硝態(tài)氮和凋落物際土壤的微生物生物量碳、基礎(chǔ)呼吸、可溶性有機(jī)氮的影響達(dá)到顯著水平。轉(zhuǎn)Bt水稻總體上降低了線蟲的數(shù)量，尤其在苗期和拔節(jié)期的凋落物際土壤中達(dá)到顯著水平；苗期凋落物際和交互微域內(nèi)土壤食微線蟲數(shù)量受水稻品種的顯著影響。由于根系和凋落物是作物直接影響土壤群落的重要因素，因此結(jié)合二者進(jìn)行評價能夠更全面地反映和預(yù)警轉(zhuǎn)Bt作物對土壤生物的影響。今后有必要結(jié)合大田以及微域?qū)嶒?yàn)的長期研究，以評估轉(zhuǎn)基因作物對土壤非靶標(biāo)生物群落的生態(tài)風(fēng)險。

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Influences of rhizosphere and detritusphere ofBtrice on soil nematode communities

QI Lin1, LIU Manqiang1,2,*, JIANG Linhui1, ZHANG Jianqiao1, LI Xiuqiang1, CHEN Fajun3, HU Feng1

1SoilEcologyLab,CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China2StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China3DepartmentofEntomology,CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

It is important to evaluate the ecological risks of transgenicBtrice on soil non-target organisms before it is widely released in the market. Rhizosphere and detritusphere formed by plant roots and organic residues that contact soil directly, and represent two distinct microsites that are highly affected by plants. Pot experiments were established to investigate the effects of rice, a variety genetically modified to express theBtprotein, KMD, and its parental line, XSD, on soil chemical, microbial properties and nematode assemblages of the two microsites. Results indicated that effects of transgenicBtrice on soil properties varied with plant growth stage and microsite type. Compared with XSD, KMD increased the concentrations of soil dissolved organic nitrogen in detritusphere (D) at seedling and elongation stages, whereas the concentrations of ammonium in the detritusphere were decreased significantly by KMD at seedling stage (P<0.05). At maturing stage, KMD increased the concentrations of ammonium in the detritusphere and overlapped microsite (DR, i.e. the area that affected by both rhizosphere and detritusphere) significantly (P<0.05). With regard to soil microbial biomass, KMD significantly increased the concentrations of soil microbial biomass carbon (MBC) in detritusphere at seedling and maturing stages (P<0.05), whereas significantly decreased microbial biomass nitrogen (MBN) in rhizosphere at elongation and maturing stages (P<0.05). Integrated effects of the two microsites had a significant effect on concentrations of microbial biomass carbon and nitrogen as well as dissolved organic matter, total nematode numbers and nematode numbers of different feeding groups (P<0.05). Generally, KMD decreased the total nematode numbers, especially there were significantly fewer nematodes in the detritusphere of KMD than XSD at seedling and elongation stages (P<0.05). Repeated-measure ANOVA indicated that transgenicBtrice KMD had significant effects on numbers of bacterial feeders (P<0.01) and fungal feeders (P<0.05), nematode channel ratio (NCR) and enrichment index (EI). In addition, the genetically modified KMD significantly decreased (P<0.05) the proportions of bacterial feeders and fungal feeders in detritusphere at seedling and elongation stages, and such trends were consistent to the responses of ammonium concentrations of the same microsite and growth stage. In light of soilBtprotein concentrations under KMD treatments after maturing stage,Btrice showed no significant effect, though the content ofBtprotein in straw of KMD was significantly higher than that of XSD, indicating that significant differences of effects of KMD from XSD might not result fromBtprotein itself, but from the difference of other traits such as rice growth and residue chemical composition. Together, we found that microsite studies combining the rhizosphere and detritusphere would facilitate to demonstrate the responses of soil microbial properties and nematode assemblages to explore the ecological impacts and mechanisms of growing genetically modified rice.

transgenicBtrice; rhizosphere; detrisphere;Btprotein; nematode assemblage

土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(0812201218); 轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2013ZX08012- 005); 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)SRT項(xiàng)目(201206); 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科(PAPD)

2013- 05- 14;

日期:2014- 04- 17

10.5846/stxb201305141061

*通訊作者Corresponding author.E-mail: liumq@njau.edu.cn

戚琳，劉滿強(qiáng)，蔣林惠，張楗嶠，李修強(qiáng)，陳法軍，胡鋒.基于根際與凋落物際評價轉(zhuǎn)Bt水稻對土壤線蟲群落的影響.生態(tài)學(xué)報,2015,35(5):1434- 1444.

Qi L, Liu M Q, Jiang L H, Zhang J Q, Li X Q, Chen F J, Hu F.Influences of rhizosphere and detritusphere ofBtrice on soil nematode communities.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1434- 1444.