張付闖，石元朔，高 慧 ，黃長江，董巧香*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州 3 25035;2.美國德克薩斯大學(xué)健康醫(yī)學(xué)中心，美國圣安東尼奧 7 8229-3900)

雙酚 A(bisphenol A，BPA)，學(xué)名 2，2-二(4-羥基苯基)丙烷，是目前世界范圍內(nèi)使用量最大的化學(xué)物質(zhì)之一，主要用于工業(yè)生產(chǎn)塑料，環(huán)氧樹脂等。日常生活中，礦泉水瓶、食品包裝袋、醫(yī)療器械、牙科填充劑等都含有雙酚A。雙酚A在正常使用過程中可以從食物、飲料容器、牙齒密封劑及其他含有該物質(zhì)的物品中泄漏出來。研究顯示，在人體的血清、尿液、羊水、濾泡膜以及胎盤等中均檢測(cè)到雙酚A的存在［1-4］。2003-2004年，美國健康和營養(yǎng)調(diào)查協(xié)會(huì)對(duì)6歲以上不同年齡和性別的調(diào)查者尿樣進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，92%以上人的尿樣中檢測(cè)到BPA［5-6］。近期對(duì)上海地區(qū)8～15歲兒童的尿樣檢測(cè)顯示，84.9%的樣本能檢測(cè)到雙酚A［7］。雙酚A的暴露是普遍存在的，應(yīng)該引起人們足夠的重視。

低劑量暴露雙酚A能夠引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。雙酚A對(duì)雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)和雌激素受體β(estrogen receptorβ，ERβ)具有一定的親和力，這種親和力相對(duì)于內(nèi)源性雌激素要低很多［8］。在有些情形下，雙酚A具有和雌激素相同的效力。除了與ERα和ERβ結(jié)合外，雙酚A可與 G-蛋白偶聯(lián)受體 30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)結(jié)合發(fā)揮作用［9］。目前，已經(jīng)提出多個(gè)雙酚A可能作用的靶點(diǎn)，大量的研究結(jié)果顯示，雙酚A的一些代謝產(chǎn)物更能起到模擬雌激素的作用。

以小鼠和大鼠為模型的研究結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期暴露環(huán)境劑量的雙酚A可導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的惡性改變，而這種改變?cè)陔S后的發(fā)展過程中可能形成乳腺瘤［8，10］。雙酚A的暴露同樣也能增加青春期乳腺導(dǎo)管對(duì)內(nèi)源性雌激素的敏感性。早期雙酚A暴露導(dǎo)致的乳腺導(dǎo)管組織的異常變化在乳腺后期的發(fā)展變化過程中一直存在。圍產(chǎn)期前，大鼠暴露雙酚A能夠增加乳腺癌前期病變和原位腫瘤的發(fā)生概率，同時(shí)在后期的發(fā)展過程中更容易形成乳腺癌［11］。因而，雙酚A很有可能是一種潛在的乳腺致癌物。

本研究首次采用FVB GFP品系雌性小鼠研究雙酚A暴露對(duì)哺乳期結(jié)束后的小鼠乳腺、卵巢和子宮變化的影響。通過對(duì)乳腺的異常變化分析及對(duì)雙酚A在乳腺病變發(fā)展過程中的作用進(jìn)行探索，為雌激素內(nèi)分泌干擾物對(duì)乳腺的影響及乳腺癌的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3月齡FVB GFP小鼠購自美國 Jackson實(shí)驗(yàn)室。初始為雌雄各一只，在德克薩斯大學(xué)健康醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)規(guī)則繁殖。實(shí)驗(yàn)過程中所用器具及飼料均不含雙酚A，繁殖至得到滿足本試驗(yàn)需要的相同年齡組的雌鼠個(gè)數(shù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

動(dòng)物麻醉系統(tǒng)購自美國Microflex公司，剪刀購自美國Harvard Apparattus公司，滲透泵購自美國Alzet公司，動(dòng)物解剖顯微鏡購自日本Nikon公司，石蠟切片機(jī)購自美國Leica公司。

1.1.3 試劑耗材

雙酚A粉末購自美國Sigma公司;二甲基亞砜購自美國Sigma公司;吉姆薩染液購自美國Ricca chemical公司;Ki67抗體 (RM-9106)購自美國Thermo公司;酒精，福爾馬林，二甲苯溶液，Citri-Solv溶液和WM封片劑均購自美國Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及雙酚A暴露

對(duì)2.5月齡的FVB GFP雌性小鼠進(jìn)行交配，看到陰道栓的當(dāng)天記為懷孕的第1天。懷孕8 d后將孕鼠隨機(jī)分為3組，用滲透泵連續(xù)28 d暴露于BPA環(huán)境中。BPA溶解于50%的二甲基亞砜，每日處理劑量分別為0，25，250 ng·kg-1。每個(gè)處理7個(gè)重復(fù)。

1.2.2 小鼠陰道細(xì)胞的收集

哺乳期結(jié)束后1個(gè)月，用異氟烷麻醉小鼠30 s，頸椎脫臼小鼠。處死小鼠后，立即用滴管吸取少量水打入陰道，反復(fù)吸入吸出，將含有陰道細(xì)胞的水溶液涂在載玻片上，制作陰道細(xì)胞涂片。吉姆薩染色液進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞的組成。

1.2.3 乳腺、子宮和卵巢組織的收集和處理

陰道細(xì)胞采集完后，腹部朝上固定小鼠，用外用手術(shù)刀在腹部近陰道中央處，頸椎線向頭部方向，上皮做一個(gè)切口，注意不要剪破腹腔膜。中線向四肢方向上皮各做一個(gè)切口，拉扯并固定小鼠外皮。用內(nèi)用手術(shù)刀及鑷子取下小鼠腹股溝區(qū)乳腺和胸部乳腺。乳腺取下后，分別進(jìn)行全組織染色和常規(guī)石蠟組織切片。

收集母鼠子宮和卵巢組織時(shí)，取下后快速將其放入含有福爾馬林緩沖溶液的器皿中，在顯微鏡下去除子宮及卵巢邊緣的其他脂肪組織，直至觀察到子宮及邊緣色澤單一且光滑為止。組織固定完全后，轉(zhuǎn)移至70%的酒精中保存。測(cè)量組織寬度和重量數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)保證組織處于正常自然延伸狀態(tài)，統(tǒng)一使子宮棕色胎位點(diǎn)側(cè)向上，解剖顯微鏡下拍照保存。使用精密天平測(cè)重量前，用吸水紙將組織外的酒精吸取完全并快速稱量，酒精具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，所以應(yīng)防止吸干后在外邊時(shí)間過長而損壞組織。

1.2.4 乳腺增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的定量分析

乳腺導(dǎo)管的病理學(xué)切片HE染色后可以觀察到四種導(dǎo)管形態(tài)，包括以正常的雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)為主的乳腺導(dǎo)管、多個(gè)細(xì)胞層增生性病變的導(dǎo)管、非典型腺管增生的導(dǎo)管和發(fā)生原位癌的導(dǎo)管。顯微鏡下對(duì)以上乳腺導(dǎo)管形態(tài)分別觀察計(jì)數(shù)，進(jìn)一步可以計(jì)算得到每個(gè)樣品中四種形態(tài)總的導(dǎo)管個(gè)數(shù)。增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)所占的百分比/%=增生性導(dǎo)管個(gè)數(shù)/總的導(dǎo)管個(gè)數(shù)×100。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色的定量分析

顯微鏡下觀察Ki67免疫組織化學(xué)染色后的切片，并對(duì)每個(gè)樣品中的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出總的導(dǎo)管個(gè)數(shù)。以單個(gè)乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)為單位，Ki67陽性染色后構(gòu)成導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，當(dāng)棕黃色細(xì)胞核數(shù)占該導(dǎo)管總細(xì)胞核數(shù)比例大于或等于10%時(shí)，認(rèn)為導(dǎo)管有Ki67表達(dá)并以此計(jì)數(shù)。Ki67表達(dá)導(dǎo)管所占百分比/%=Ki67表達(dá)導(dǎo)管個(gè)數(shù)/總的導(dǎo)管個(gè)數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及T檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05時(shí)判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌鼠動(dòng)情周期變化觀察

顯微鏡下觀察吉姆薩染色后的小鼠陰道細(xì)胞涂片，如圖1所示 (比例尺50μm)。動(dòng)情前期，卵泡生長加速，可觀察到大量有核上皮細(xì)胞及少量角質(zhì)化細(xì)胞;動(dòng)情期，卵泡成熟、排卵，顯微鏡下滿視野角質(zhì)化上皮細(xì)胞及少量有核上皮細(xì)胞;動(dòng)情間期，黃體退化，顯微鏡下可以同時(shí)看到白血球、有核上皮細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞;動(dòng)情后期，黃體生成，顯微鏡視野下絕大部分為白血球細(xì)胞。小鼠動(dòng)情周期的不同階段對(duì)小鼠的乳腺的影響很大，處于動(dòng)情后期的乳腺分支芽端明顯較其他時(shí)期增多，本實(shí)驗(yàn)中所有用于分析的小鼠均不在動(dòng)情后期。

圖1 母鼠動(dòng)情周期變化

2.2 雙酚A暴露對(duì)母鼠子宮及卵巢的影響

子宮和卵巢作為重要的生殖器官對(duì)乳腺的正常發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用。如圖2所示 (比例尺5 mm)，各處理組間子宮寬度、子宮和卵巢總重及卵巢重均無顯著差異 (P＜0.05)。通過分析典型的子宮含有卵巢的照片發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組子宮兩側(cè)的胎位點(diǎn)數(shù)相差很大，為不對(duì)稱型分布;經(jīng)雙酚A暴露的處理組，母鼠子宮兩側(cè)的胎位點(diǎn)數(shù)則更為對(duì)稱，相差較小。

圖2 母鼠子宮寬度和子宮及卵巢的重量變化

2.3 雙酚A暴露對(duì)母鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)的影響

為評(píng)價(jià)不同劑量雙酚A暴露對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管的影響，用胭脂紅染液進(jìn)行乳腺全組織染色，WM封片劑封片，解剖顯微鏡下觀察乳腺導(dǎo)管密度和分支結(jié)構(gòu)的變化。如圖3所示 (比例尺100μm)，經(jīng)雙酚A暴露的母鼠乳腺較對(duì)照組發(fā)生極其明顯的變化。對(duì)照組乳腺導(dǎo)管具有清晰完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三次分支結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比，雙酚A暴露組導(dǎo)管密度明顯增大，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三次分支結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常變化。雙酚A處理組的母鼠乳腺導(dǎo)管寬度明顯大于對(duì)照組，250 ng·kg-1雙酚A處理組母鼠乳腺變化最為明顯。

2.4 雙酚A暴露對(duì)母鼠乳腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

圖3 母鼠乳腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)

圖4 母鼠乳腺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)

如圖4所示 (比例尺為50μm)，正常的乳腺導(dǎo)管為雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，病變后多個(gè)細(xì)胞層的增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)增加。定量計(jì)算所有非正常雙層細(xì)胞乳腺導(dǎo)管所占的百分比，分析結(jié)果顯示，0，25，250 ng·kg-1中增生性的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)百分比分別為14.0%，45.6%和29.5%，雙酚A暴露組非正常雙層細(xì)胞乳腺導(dǎo)管的比例與對(duì)照組相比均具有顯著意義的提高 (P＜0.001)。說明雙酚A確實(shí)能顯著增加乳腺病理性病變。

2.5 雙酚A暴露對(duì)母鼠乳腺導(dǎo)管Ki67表達(dá)的影響

Ki67是一種核蛋白，主要在增殖細(xì)胞中表達(dá)。為進(jìn)一步分析雙酚A暴露對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管的影響，對(duì)樣品進(jìn)行Ki67免疫組織化學(xué)染色。如圖5所示(比例尺為50μm)，25 ng·kg-1雙酚 A處理組Ki67表達(dá)導(dǎo)管百分比極顯著高于對(duì)照組 (P＜0.001);250 ng·kg-1中Ki67表達(dá)導(dǎo)管百分比為14.8%，與對(duì)照組7.8%相比顯著上升 (P＜0.01)。表明雙酚A暴露能夠顯著增加Ki67表達(dá)導(dǎo)管所占的比例。

圖5 母鼠乳腺導(dǎo)管Ki67表達(dá)率

3 小結(jié)與討論

雙酚A作為一種重要的工業(yè)化合物，因其在日常生活中普遍存在且可能作為一種潛在的乳腺癌致癌物而引起越來越多的重視。對(duì)CD-1的小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，暴露環(huán)境劑量的雙酚A可以使小鼠1月齡時(shí)乳腺導(dǎo)管填充脂肪墊的比例增加，同時(shí)也可以顯著增加6月齡小鼠末端芽的數(shù)目［12］。另外，大量的實(shí)驗(yàn)也表明環(huán)境雌激素雙酚A的暴露可以改變?nèi)橄賹?duì)自身分泌激素的敏感性［13］，增加后期對(duì)乳腺癌患病的易感性［14］。雙酚A誘導(dǎo)乳腺增生的機(jī)制性研究有待繼續(xù)。

本研究針對(duì)FVB GFP品系受孕第9天雌性小鼠通過泵移植進(jìn)行雙酚A暴露。結(jié)果表明，雙酚A顯著改變了雌鼠導(dǎo)管的正常發(fā)育形態(tài)。低劑量雙酚A處理組和高劑量雙酚A處理組雌鼠導(dǎo)管密度較對(duì)照組明顯升高，導(dǎo)管的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三次分支結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了異常的變化。雙酚A暴露組子宮寬度和卵巢的重量與對(duì)照組相比無顯著性差異 (P＞0.05)，雙酚A暴露后對(duì)卵巢和子宮的總重量無明顯作用，與已發(fā)表結(jié)果相一致［15］。雙酚A處理后雌性小鼠子宮兩側(cè)的胎位點(diǎn)分布較對(duì)照組分布更為對(duì)稱，因而可以判斷雙酚A暴露可能對(duì)雌性小鼠受精著床有一定影響。作為雌激素和孕酮等的分泌器官［16］，雙酚A的暴露對(duì)卵巢產(chǎn)生的微小變化極有可能影響到對(duì)乳腺導(dǎo)管的調(diào)控，進(jìn)而呈現(xiàn)出乳腺導(dǎo)管的異常變化。對(duì)乳腺組織的病理學(xué)結(jié)構(gòu)特征分析，低劑量和高劑量雙酚A暴露均能增加增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為該結(jié)構(gòu)占總體導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的百分比較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.001)。25，250 ng·kg-1雙酚A暴露后Ki67表達(dá)導(dǎo)管所占百分比與對(duì)照組相比顯著性升高 (P＜0.01)。乳腺導(dǎo)管密度、分支結(jié)構(gòu)、主導(dǎo)管寬度和病理學(xué)結(jié)構(gòu)的異常變化是乳腺病變發(fā)展過程中的重要危險(xiǎn)參考因素［10］。

本試驗(yàn)首次采用FVB GFP轉(zhuǎn)基因品系受孕小鼠進(jìn)行雙酚A暴露，并對(duì)哺乳結(jié)束1個(gè)月后的乳腺進(jìn)行分析，結(jié)果表明FVB GFP轉(zhuǎn)基因小鼠是研究雙酚A誘發(fā)乳腺異常變化的敏感動(dòng)物模型。雌性小鼠對(duì)于孕期暴露雙酚A十分敏感，雙酚A改變了導(dǎo)管的正常發(fā)育并且使增生性導(dǎo)管的比例顯著性增加。本次研究可以為雙酚A對(duì)乳腺的影響提供一定參考，同時(shí)對(duì)人類有效預(yù)防乳腺病變及乳腺癌的臨床診斷，治療及預(yù)后有醫(yī)學(xué)參考價(jià)值。

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