梁 波

(中山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東中山 528403)

隨著生活水平的提高及保健意識的加強，人們希望能夠更容易地從日常的飲食中補充所需的營養(yǎng)元素。許多功能性維生素飲料 (以強化維生素B族及Vc居多)由此而生。目前國家標準中推薦的維生素檢測方法是微生物法或高效液相色譜法，但這些方法檢測時間長，操作復雜，且不能同時檢測多種維生素。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS)技術(shù)由于效率高、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點越來越多地用于食品污染物和營養(yǎng)成分的檢測。基于此，本文采用UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了同時定性、定量測定飲料中維生素B1，B3，B6，B12以及Vc含量的方法，方法處理簡單、快速，適用性強。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為市場上某品牌維生素飲料。試劑有1%三氯乙酸，甲酸 (色譜純，德國Merck公司)，甲醇 (色譜純)，維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6(鹽酸吡多醇)、維生素B12及Vc標準物質(zhì)購自德國Dr.Ehrenstorfer Gmbhgong公司，試驗用水均為超純水。

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀 (美國WATERS公司，UPLC-XevoTQ)，分析天平 (感量為0.000 1 g和0.01 g，賽多利斯)，冷凍離心機為德國Sigma 3～18 k，色譜柱為ACQUITY UPLCr HSSC18 1.7或同等性能色譜柱。

1.2 儀器工作條件

色譜-質(zhì)譜條件。流速0.2 mL·min-1，柱溫40℃，樣品溫度15℃;流動相A為1%甲酸水溶液，B為100%甲醇。梯度洗脫程序:0～2 min用98%A∶2%B，2～3 min用 45%A∶55%B，3.0～3.5 min用2%A∶98%B，3.5～5 min用98%A∶2%B。

離子源為電噴霧離子源 (ESI)，掃描模式為正離子掃描，檢測方式為多反應監(jiān)測 (MRM)，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度600℃，脫溶劑氣(N2)，流量1 200 L·h-1;毛細管電壓3.0 kV。

1.3 樣品提取

不含乳脂樣品。準確稱取搖勻后的樣品2 g，直接用流動相定容至25 mL，混勻后過0.22μm濾膜，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

含乳脂樣品。準確稱取搖勻后的樣品2 g，加入1%鹽酸溶液5 mL，混勻后加入5 mL甲醇溶液，用蒸餾水定容至 25 mL，6 000 r·min-1離心20 min，取上清液過0.22μm濾膜，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。若樣品 (含乳飲料)中增稠劑含量較高，加入1%鹽酸溶液仍處于懸濁液狀態(tài)，可將已加入鹽酸的樣品至于0～2℃條件下冷凍5 min，即可見有沉淀產(chǎn)生，然后立即6 000 r·min-1離心20 min，取上清液，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取

由于待測物質(zhì)都是水溶性的，所以大部分的功能飲料不需要前處理，可以直接以流動相定容待測。但添加了增稠劑或乳粉的功能飲料就必須作特殊前處理，若按常規(guī)加入沉淀劑 (如亞鐵氰化鉀+乙酸鋅)會導致待測化合物損失較大。經(jīng)過反復加標試驗研究，先加入鹽酸能使飲料中蛋白沉淀，再加入甲醇能破壞增稠劑的活性，然后0～2℃條件下急冷、離心，即可獲得澄清的提取液，且不會造成待測物質(zhì)的損失。

2.2 色譜條件的選擇

流動相的組成和比例既影響物質(zhì)的分離又影響靈敏度，由于要檢測的化合物都是水溶性，且在處理過程有加入甲醇，經(jīng)研究，流動相選擇1%甲酸水溶液和甲醇 (有機相選擇其他容易有溶劑效應產(chǎn)生)較理想，流動相比例采用梯度洗脫可以使化合物分離效果更好，峰型也更好。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將標準混合液直接打進質(zhì)譜進行條件摸索，分別在正負2種離子模式下進行母離子全掃描，結(jié)果表明，待測化合物在正離子掃描模式下響應值較高(圖1)，因此以正離子模式進行二級質(zhì)譜掃描獲得子離子質(zhì)譜信息，選擇2個豐度較高而且穩(wěn)定的子離子作為定性離子和定量離子，得到每種物質(zhì)的最佳質(zhì)譜參數(shù) (表1)，但由于B12結(jié)構(gòu)式穩(wěn)定，較難電離因此需在標準液中加入1%甲酸以促進電離。

圖1 4種維生素B及Vc標準溶液的UPLC-MS/MS圖

表1 MRM監(jiān)測模式下質(zhì)譜優(yōu)化條件

2.4 線性范圍與檢出限

配制不同濃度混合標準工作溶液，注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，記錄色譜峰面積，以質(zhì)量濃度Y為縱坐標，色譜峰面積X為橫坐標作校正曲線，得到線性回歸方程。5種維生素在5.0～20.0μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性方程和檢出限見表2。

表2 5種維生素標準曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 方法回收率與精密度

在不含目標待測化合物的飲料中添加3個不同濃度水平的混合標準液，按1.3法前處理后進行試驗，每個試驗重復6次，結(jié)果見表3。由表3可知，VB1，VB3，VB6，VB12，Vc加標回收率均符合檢測要求。

表3 5種維生素標準物質(zhì)在樣品中的加標回收率

2.6 樣品測定

用某品牌的功能飲料試液進行質(zhì)譜分析，以2對離子對定性，按外標法定量，用回歸曲線求出樣品含量，同時用微生物方法測定同一樣品中維生素B1，B3，B6，B12的 含 量， 并 按 照 GB/T 5009.154—2003食品中維生素 B6的測定、GB/T 5009.89—2003食品中維生素B3的測定方法測定。由表4可知，UPLC-MS/MS法測定的結(jié)果與標準方法結(jié)果基本一致，無顯著性差異，但是所需時間更短。

表4 樣品中各種維生素的含量

3 小結(jié)

比較UPLC-MS/MS法和微生物檢測的結(jié)果可知，UPLC-MS/MS法可同時測定飲料中維生素B1，B3，B6，B12，Vc的含量，而且方法靈敏度、精密度高，測定結(jié)果準確可靠，比微生物法節(jié)省時間，能排除假陽性干擾，定量準確，使用此方法檢測飲料中維生素B1，B3，B6，B12，Vc會大大提高日常檢測工作效率，可以在檢測機構(gòu)和相關(guān)企業(yè)中應用和推廣。

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準:GB 5413.13—2010嬰幼兒食品和乳品中維生素 B6的測定［S］.北京:中國標準出版社，2010.

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