喻 良，黃雨蘭，黃 斌，孫紅斌

氯吡格雷是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗血小板藥物，可以有效地預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化患者缺血性事件的發(fā)生，由于其出血風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)于阿司匹林少，可以替代阿司匹林作為預(yù)防心、腦血管疾病的重要藥物［1］。但臨床上發(fā)現(xiàn)，部分患者即使長(zhǎng)期、規(guī)律的服用氯吡格雷，仍有卒中復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，這種現(xiàn)象稱為“氯吡格雷抵抗”［2，3］?！奥冗粮窭椎挚埂卑l(fā)生的機(jī)制目前尚不十分明確，以往的研究提示其可能與參與氯吡格雷代謝的CYP2C19 基因多態(tài)性、患者并存的基礎(chǔ)病及并發(fā)癥以及藥物之間的相互作用等有關(guān)，其中CYP2C19 基因多態(tài)性與“氯吡格雷抵抗”是近年研究的熱點(diǎn)。但已有的研究大多數(shù)集中在急性冠脈綜合征、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后等心血管疾病的預(yù)防方面［4～6］，而在腦梗死方面的研究相對(duì)較少，氯吡格雷在腦梗死的治療及二級(jí)預(yù)防中所起的作用是否與心血管疾病中相同則有待進(jìn)一步研究。本研究將初次發(fā)生腦梗死后服用氯吡格雷≥1 y 的患者根據(jù)卒中是否復(fù)發(fā)分為腦梗死復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組，分別測(cè)定其CYP2C19 基因型并對(duì)兩組進(jìn)行比較，探討CYP2C19 基因多態(tài)性對(duì)長(zhǎng)期服用氯吡格雷的腦梗死患者卒中復(fù)發(fā)的影響。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

入選標(biāo)準(zhǔn):所有患者均來自2013 年11 月～2014 年5 月我院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院的患者;年齡18～80 歲;≥1 y 前曾經(jīng)發(fā)生臨床及頭顱CT 或MRI證實(shí)的初發(fā)非心源性腦梗死;服用氯吡格雷(75 mg/d)≥1 y;初發(fā)腦梗死后未再吸煙及酗酒;所有受試者均知情同意，并簽署知情同意書。

腦梗死復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn):患者出現(xiàn)新的癥狀及體征，并經(jīng)頭顱CT 或MRI 證實(shí)。

排除標(biāo)準(zhǔn):服用氯吡格雷(75 mg/d)1 y 內(nèi)腦梗死復(fù)發(fā);合并腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病;過去1 y 使用質(zhì)子泵抑制劑、抗癲癇藥物、抗抑郁藥物、鎮(zhèn)靜催眠藥物、抗真菌藥物及其他抗血小板藥物等。

1.2 方 法

1.2.1 分組及樣本收集 根據(jù)入組時(shí)腦梗死是否復(fù)發(fā)將患者分為腦梗死復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組。并于早晨8 點(diǎn)抽取空腹外周靜脈血2 ml，應(yīng)用DNA 提取試劑盒(中國(guó)上海百傲科技有限公司)，從外周血中提取基因組全血DNA，將提取的DNA 在-20 ℃存儲(chǔ)備用。

1.2.2 基因芯片法測(cè)定CYP2C19 基因多態(tài)利用“CYP2C19 基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)”(中國(guó)上海百傲科技有限公司)檢測(cè)目的基因的基因型:全血DNA提取、目的基因PCR 擴(kuò)增、芯片雜交顯色、將芯片上的色斑經(jīng)信號(hào)放大，通過基因芯片圖像分析軟件Array Doctor V2.0 對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描和自動(dòng)判讀，給出CYP2C19 基因SNP 信息，并設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制。以上步驟嚴(yán)格按照儀器和試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本資料比較

共入選患者78 例，其中男47 例，女31 例，腦梗死復(fù)發(fā)組32 例，腦梗死未復(fù)發(fā)組46 例。兩組患者在性別、年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂等的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)(見表1)。

2.2 CYP2C19 基因多態(tài)性

兩組患者基因芯片法檢測(cè)出6 種基因型:強(qiáng)代謝型(extensive metabolizers，EM):CYP2C19* 1/* 1型;中間代謝型(intermediate metabolizers，IM):CYP2C19* 1/* 2 型和CYP2C19* 1/* 3 型;弱代謝型(poor metabolizers，PM):CYP2C19* 2/* 2 型、CYP2C19* 2/* 3 型和CYP2C19* 3/* 3 型(見表2)。所檢的78 例其CYP2C19* 1、CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 等位基因頻率分別是61.54%、33.33%、5.13%，其分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表3)。

2.3 CYP2C19 基因多態(tài)性與腦梗死復(fù)發(fā)的關(guān)系

腦梗死未復(fù)發(fā)組CYP2C19 * 1 等位基因頻率為76.1%，顯著高于腦梗死復(fù)發(fā)組40.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而腦梗死未復(fù)發(fā)組CYP2C19* 2 等位基因頻率(19.6%)顯著低于腦梗死復(fù)發(fā)組(53.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);兩組CYP2C19* 3 等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。腦梗死未復(fù)發(fā)組CYP2C19*1/* 1 基因型(58.7%)顯著高于腦梗死復(fù)發(fā)組(18.8%)，差異顯著(P＜0.001);而CYP2C19* 2/* 2 基因型腦梗死未復(fù)發(fā)組(4.3%)則顯著低于復(fù)發(fā)組(31.3%)，差異顯著(P＜0.01);而兩組CYP2C19* 1/* 2、CYP2C19* 1/* 3、CYP2C19* 2/* 3、CYP2C19* 3/* 3 基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)(見表3)。

表1 腦梗死復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組一般資料比較

表2 CYP2C19 等位基因、基因型及代謝型

表3 兩組患者CYP2C19 等位基因及基因型頻率分布

3 討論

氯吡格雷本身不具備抗血小板活性，須經(jīng)體內(nèi)肝微粒體酶系統(tǒng)的細(xì)胞色素P450 酶系中的CYP2C19 酶代謝，才能轉(zhuǎn)化成活性產(chǎn)物，發(fā)揮其抗血小板作用。編碼CYP2C19 酶的基因具有高度的多態(tài)性。在亞洲人群中，最常見的等位基因?yàn)镃YP2C19 * 1，CYP2C19 * 2 和 CYP2C19 * 3，CYP2C19* 5 和CYP2C19* 6，其中CYP2C19* 1 為野生型，其余為變異型。野生型編碼的酶具有良好的酶活性，此類患者服用氯吡格雷后能夠較好地抑制血小板活性［6］，而變異型編碼的酶活性下降。CYP2C19* 2 和CYP2C19* 3 被證實(shí)為最主要的無功能等位基因，目前研究認(rèn)為 CYP2C19 * 2、CYP2C19* 3 等位基因與“氯吡格雷抵抗”有關(guān)［2，3，7］。因此Paré 等［8］將只有野生型等位基因的CYP2C19 * 1/* 1 被定義為強(qiáng)代謝型(EM)，攜帶一種無功能等位基因的CYP2C19* 1/* 2 或CYP2C19* 1/* 3 被定義為中間代謝型(IM);而攜帶兩種無功能等位基因的CYP2C19* 2/* 3，CYP2C19* 2/*2，CYP2C19* 3/* 3 被定義為弱代謝型(PM)。并呼吁根據(jù)代謝分型指導(dǎo)氯吡格雷用量。2010 年，美國(guó)食品藥品管理局在官方網(wǎng)站發(fā)出“黑框”警告，建議加強(qiáng)對(duì)氯吡格雷治療的患者進(jìn)行CYP2C19* 2 和CYP2C19* 3 等位基因的檢測(cè)［9］。但目前的證據(jù)大多來自急性冠脈綜合征、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)后等心血管疾病的預(yù)防方面［4～6］，而有關(guān)CYP2C19基因多態(tài)性在腦梗死的二級(jí)預(yù)防方面的作用相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外研究很少，證據(jù)不多。陳枝挺等［10］前瞻性納入102 例福建漢族腦梗死恢復(fù)期(≥3 m)患者，入院后給予氯吡格雷75 mg/d，于用藥后8 d，采用血栓彈力圖檢測(cè)血小板聚集抑制率，并根據(jù)血小板聚集抑制率分為氯吡格雷敏感組(≥40%)和氯吡格雷抵抗組(＜40%)。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)CYP2C19* 2 和* 3 位點(diǎn)的基因型。結(jié)果102 例患者中，氯吡格雷抵抗組27 例(26.5%)。兩組患者的CYP2C19* 2 和CYP2C19* 3 位點(diǎn)等位基因頻率和基因型總體分布不一致(P＜0.01)。氯吡格雷抵抗組的CYP2C19 * 1 等位基因頻率和CYP2C19 * 1/* 1 基因型頻率明顯低于氯吡格雷敏感組(分別為40.7%:80.0%，18.5%:61.3%，均P＜0.01)，而CYP2C19 * 2 等位基因頻率和CYP2C19 * 2/* 2 基因型頻率明顯高于氯吡格雷敏感組(分別為53.7%:18.7%，29.6%:1.3%，均P＜0.01)。Spokoyny 等［11］對(duì)53 例腦梗死和短暫性腦缺血發(fā)作患者的CYP2C19 基因型檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，5.7%為弱代謝型，26.4%為中間代謝型，62.3%為強(qiáng)代謝型，3.8%不確定型，1.9%為超快速和弱代謝的混合型(mixed ultra rapid and poor metabolizers)。43 例服用氯吡格雷的患者中，27 例強(qiáng)代謝型中有3例腦血管疾病復(fù)發(fā)(11.1%;95% CI 0.04～0.28)，12 例中間代謝型有4 例復(fù)發(fā)(33.3%;95% CI 0.14～0.61)，2 例弱代謝型有1 例復(fù)發(fā)(50%;95% CI 0.09～0.90)。說明中間代謝型和弱代謝型患者比強(qiáng)代謝型者的腦血管病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究表明，長(zhǎng)期服用氯吡格雷預(yù)防缺血性腦血管疾病的患者中，1 y 后仍然有部分患者復(fù)發(fā)，通過檢測(cè)復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者的CYP2C19 基因型發(fā)現(xiàn)，未復(fù)發(fā)組CYP2C19* 1 等位基因和CYP2C19* 1/* 1 基因型頻率顯著高于復(fù)發(fā)組，分別為76.1%:40.6%(P＜0.01)，58.7%:18.8%(P＜0.001)，而腦梗死未復(fù)發(fā)組CYP2C19* 2 等位基因頻率和CYP2C19* 2/* 2 基因型頻率顯著低于腦梗死復(fù)發(fā)組，分別為19.6%:53.1%(P＜0.01)，4.3%:31.3%(P＜0.01)。而兩組其余等位基因頻率和基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。提示復(fù)發(fā)組存在更高的CYP2C19 等位基因突變，由于患者由強(qiáng)代謝型突變?yōu)槿醮x型，所以此類患者服用氯吡格雷后未充分代謝為有活性的代謝產(chǎn)物而不能很好的起到抗血小板聚集的作用，這可能是腦梗死復(fù)發(fā)的原因之一。與既往的研究結(jié)果類似［10～12］。本研究結(jié)果提示對(duì)于需服用氯吡格雷預(yù)防腦梗死復(fù)發(fā)的患者，進(jìn)行CYP2C19 基因型的檢查是必要的，有利于根據(jù)結(jié)果調(diào)整氯吡格雷的使用。另外，本組資料顯示主要突變類型是CYP2C19* 2 等位基因，而CYP2C19*3 等位基因少見，且兩組 CYP2C19 * 1/* 2、CYP2C19* 1/* 3、CYP2C19* 2/* 3、CYP2C19* 3/* 3 基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是否與所收集的病例數(shù)較少或其他原因有關(guān)尚不清楚。

此外，盡管納入時(shí)已剔除可能干擾氯吡格雷療效的因素，但由于本研究系回顧性研究，患者在服用氯吡格雷期間，影響腦梗死復(fù)發(fā)的因素?zé)o法嚴(yán)格控制，因此有必要擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格控制干擾因素，前瞻性納入患者進(jìn)一步研究。

［1］Wong KS，Chen C，F(xiàn)u J，et al.Clopidogrel plus aspirin versus aspirin alone for reducing embolisation in patients with acute symptomatic cerebral or carotid artery stenosis(CLAIR study):a randomised，open-label，blinded-endpoint trial［J］.Lancet Neurol，2010，9(5):489-497.

［2］Hochholzer W，Trenk D，F(xiàn)rundi D，et al.Time dependence of platelet inhibition after a 600-mg loading dose of clopidogrel in a large，unselected cohort of candidates for percutaneous coronary intervention［J］.Circulation，2005，111(20):2560-2564.

［3］Buonamici P，Marcucci R，Migliorini A，et al.Impact of platelet reactivity after clopidogrel administration on drug-eluting stent thrombosis［J］.J Am Coll Cardiol，2007，49(24):2312-2317.

［4］張曉星，閆麗榮，王冬雪，等.冠心病介入治療患者CYP2C19 基因多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2014，23(1):67-71.

［5］Simon T，Verstuyft C，Mary-Krause M，et al.For french registry of acute ST-Elevation and Non-ST-Elevation myocardial infarction(FASTMI)investigators:genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events［J］.N Engl J Med，2009，360(4):363-375.

［6］Christoph V，Stefan J，David E，et al.Genetic variation of CYP2C19 affects both pharmacokinetic and pharmacodynamic responses to clopidogrel but not prasugrel in aspirin-treated patients with coronary artery disease［J］.Eur Heart J，2009，30(14):1744-1752.

［7］Rai M，Seip RL，Gupta A，et al.CYP2C19 genotype-guided antiplatelet therapy in a patient with clopidogrel resistance［J］.Conn Med，2012，76(5):267-272.

［8］Paré G，Mehta SR，Yusuf S，et al.Effects of CYP2C19 genotype on outcomes of clopidogrel treatment［J］.N Engl J Med，2010，363(18):1704-1714.

［9］U.S.Food and Drug Administration.FDA Drug Safety Communication:Reduced effectiveness of plavix(clopidogrel)in patients who are poor metabolizers of the drug［DB/OL］.2010［2010-03-12］.http://www.fda.gov/Drugs.

［10］陳枝挺，趙振華，劉昌云，等.福建漢族腦梗死患者氯吡格雷抵抗的影響因素及與CYP2C19 基因多態(tài)性的關(guān)系［J］.中國(guó)腦血管病雜志，2014，11(2):74-79.

［11］Spokoyny I，Barazangi N，Jaramillo V，et al.Reduced clopidogrel metabolism in a multiethnic population:prevalence and rates of recurrent cerebrovascular events［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2014，23(4):694-698.

［12］Jia DM，Chen ZB，Zhang MJ，et al.CYP2C19 polymorphisms and antiplatelet effects of clopidogrel in acute ischemic stroke in China［J］.Stroke，2013，44(6):1717-1719.