胡泓博，夏傳余，李光武

芳香療法在最古老的文明歷史中早有記載，至今已有六千多年的歷史。丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)，從丁香油或其它含丁香酚的芳香油中蒸餾分離而得。具有抗氧化［1］、抗驚厥［2］、解熱抗炎［3］和局部麻醉［4］等多種藥理活性，在腦血管疾病、老年性癡呆、神經(jīng)障礙、癲癇的防治中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)丁香酚通過嗅覺通路能改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、引起海馬和杏仁核的乙酰膽堿(Ach)等神經(jīng)遞質(zhì)的變化［5，6］。已有實(shí)驗(yàn)證明丁香酚腹腔注射對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注神經(jīng)保護(hù)作用［7］。因注射給藥方式不便應(yīng)用于臨床，穩(wěn)定性差，本試驗(yàn)運(yùn)用大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過丁香酚吸嗅途徑，探討丁香酚通過嗅覺通路對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠，60 只，體重220 g 左右，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。置于安靜、室溫(25±1)℃、濕度(55±2)%、自然光照的動(dòng)物飼養(yǎng)室中，自由飲水及攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

DMS-2 型Morris 水迷宮測(cè)試系統(tǒng)(上海欣曼科教設(shè)備有限公司提供);2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma 公司);Leica 石蠟病理切片(RM2135型，德國);顯微鏡(Nikon80i 型 日本);SABC 試劑盒(SP-9000，K136824B，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB 顯色試劑盒(ZLI-9018，K132429A，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗BDNF 抗體(bs-0248R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)等。

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型的建立

SD 大鼠10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。在CCA 遠(yuǎn)心端和近心端及ECA 處掛線備用。用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA 分叉部4 mm 處剪一小口，將標(biāo)記好的魚線插入到ICA，進(jìn)入ECA 與ICA 分叉處時(shí)打開動(dòng)脈夾迅速插入ICA，進(jìn)入深度約18 mm，系牢CCA 遠(yuǎn)心端的細(xì)線，將魚線尾端用黑色記號(hào)筆涂黑后留于皮膚外1 cm，消毒并縫合。2 h 后，輕輕向外抽拉魚線至ECA 主干，恢復(fù)血供，大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.4 分組及給藥

SD 大鼠80 只隨機(jī)分為4 組，每組20 只:模型組、丁香酚吸嗅組、假手術(shù)組(僅把魚線插入CCA6 mm 處，不阻塞大腦中動(dòng)脈，結(jié)扎CCA 和ECA)、正常組。丁香酚吸嗅組:將丁香酚、蒸餾水以1∶99 濃度配置，盛放于香薰燈內(nèi)，置于在密閉的香薰桶底部，并加熱，將大鼠放置中間帶孔平臺(tái)上，將實(shí)驗(yàn)盒蓋蓋上，每天吸嗅2 次，每次吸嗅1 h，吸嗅3 w;其余組于潔凈空氣中自然飼養(yǎng)。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

參照Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。無功能障礙為0 分;不能伸展左側(cè)前肢為1 分;向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2 分;向左側(cè)傾倒為3 分;無自主活動(dòng)意識(shí)為4 分;死亡為5 分。術(shù)后24 h 后評(píng)分為1～3分為實(shí)驗(yàn)用鼠。干預(yù)3 w 后每組隨機(jī)選取6 只動(dòng)物用于神經(jīng)功能評(píng)分(見表1)。

1.6 TTC 染色及梗死面積測(cè)定

干預(yù)3 w 后模型組、丁香酚吸嗅組、假手術(shù)組各隨機(jī)選取7 只斷頭取腦，連續(xù)行2 mm 冠狀切片，2%TTC 溶液，37℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定。未被TTC 染色的白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)掃描腦片，利用Image J1.41 圖像分析軟件計(jì)算梗死面積。

1.7 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

吸嗅3 w 后，通過Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。水迷宮為一直徑150cm、高40cm 的圓形水池，水深25cm，與計(jì)算機(jī)相連的攝像機(jī)位于迷宮正上方，用于同步大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。水迷宮分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ象限，在目標(biāo)象限(第Ⅱ象限)中放置直徑10cm 的平臺(tái)，沒入水下2cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫控制在22～24 ℃，用墨汁將迷宮內(nèi)水染成黑色。實(shí)驗(yàn)前先將大鼠放入迷宮中熟悉環(huán)境，訓(xùn)練2 d，每日進(jìn)行2 次測(cè)試(上下午各1 次)。

1.7.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 受將大鼠從Morris 水迷宮的4 個(gè)不同象限的固定入水點(diǎn)投入水池中。記錄2 min 內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min 內(nèi)找到平臺(tái)，記錄其實(shí)際逃避潛伏期;如果大鼠在2 min 內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引上平臺(tái)并停留10 s，逃避潛伏期記錄為2 min。每天一次(下午2:00，時(shí)間固定)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 d。

1.7.2 空間探索試驗(yàn) 7 d 時(shí)撤出平臺(tái)，然后在第Ⅳ象限同一入水點(diǎn)將大鼠投入水池中，測(cè)其2 min內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.8 樣本取材及海馬CA3區(qū)BDNF 免疫組化

水迷宮試驗(yàn)后，將大鼠麻醉，0.9%生理鹽水心臟灌注，斷頭取腦，腦組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，SABA 法免疫染色。每組取5張切片，400 倍顯微鏡下觀察和拍照。采用(Image-Pro Plus)6《專業(yè)圖像分析軟件》分析所得圖片，并比對(duì)大鼠大腦圖譜，對(duì)大鼠海馬CA3區(qū)進(jìn)行圖像分析，檢測(cè)BDNF 在海馬CA3區(qū)陽性反應(yīng)物平均光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s 表示，組間均數(shù)的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

見表1。評(píng)分結(jié)果顯示，丁香酚組對(duì)腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能有不同程度的保護(hù)作用。丁香酚組與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。

2.2 TTC 染色結(jié)果

大鼠腦缺血/再灌注后均出現(xiàn)不程度的缺血梗死，丁香酚組梗死灶面積/腦切片面積與模型組比較明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)(見圖1、表2)。

2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，模型組的逃避潛伏期最長，明顯長于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05);而丁香酚吸嗅組的逃避潛伏期短于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);在空間探索實(shí)驗(yàn)中(見圖3)，模型組的動(dòng)物存在明顯記憶障礙，每分鐘穿越隱匿平臺(tái)位置平均次數(shù)最少，并且常有朝向錯(cuò)誤，與正常組比較差異有顯著性意義(P＜0.05);丁香酚吸嗅組的平均探索次數(shù)明顯多于模型組，兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.4 丁香酚吸嗅對(duì)MCAO 模型大鼠腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達(dá)量的影響

根據(jù)大鼠腦海馬區(qū)定位圖譜，本實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達(dá)量采用(Image-Pro Plus)6《專業(yè)圖像分析軟件》分析所得圖片平均光密度經(jīng)組間比較，丁香酚組、正常組、假手術(shù)組與模型組P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。假手術(shù)組、正常組BDNF 的免疫反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，免疫反應(yīng)物為棕褐色，分布于胞漿內(nèi);丁香酚組BDNF 的免疫反應(yīng)中等;模型組BDNF 的免疫反應(yīng)較弱，且細(xì)胞數(shù)量減少(見圖5)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s)

與模型組比較△P＜0.01

表2 TTC 染色梗死面積(±s)

表2 TTC 染色梗死面積(±s)

與模型組比較△P＜0.01

表3 丁香酚吸嗅對(duì)大鼠逃避潛伏期的影響(±s)

表3 丁香酚吸嗅對(duì)大鼠逃避潛伏期的影響(±s)

與模型組相比* P＜0.05;與模型組相比△P＜0.01

圖1 TTC 染色結(jié)果

圖2 丁香酚吸嗅對(duì)大鼠逃避潛伏期的影響(±s，n=10)

圖3 空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)(±s，n=10)

圖4 腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達(dá)量平均光密度結(jié)果比較(±s，n=10)

圖5 海馬CA3區(qū)BDNF 的免疫組化(SABC×400)

3 討論

腦缺血，是指各種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，使局部腦組織發(fā)生不可逆性損害，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀，具有發(fā)病率高、致殘率高、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，居腦血管病死亡原因之首。目前對(duì)缺血再灌注性腦損傷后繼發(fā)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制并無定論。氧化損傷、免疫炎癥介質(zhì)釋放、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失與釋放與腦缺血再灌注損傷病程及損傷程度密切相關(guān)［9］，在臨床上尚無針對(duì)神經(jīng)元損傷后的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥物。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)于1982年Brade 等首次從豬腦中純化得出，發(fā)現(xiàn)其具有防止神經(jīng)元死亡功能并廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)［10］。BDNF 表達(dá)廣泛，包括大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦、小腦，其中皮質(zhì)和海馬含量最高［11］。BDNF 于腦缺血的早期階段即可被誘導(dǎo)大量表達(dá)，作用于腦缺血再灌注損傷的各個(gè)環(huán)節(jié)，并能從多個(gè)方面抑制腦缺血再灌注后的各種有害反應(yīng)，起到極為重要的神經(jīng)保護(hù)作用［12］。主要表現(xiàn)在以下幾方面:

(1)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡:通過體外給予每天2.1 μg BDNF 的輸液泵治療，2 d 后，深靜脈閉塞的大鼠平均腦梗死體積明顯減小，TUNEL 陽性凋亡細(xì)胞檢測(cè)明顯小于對(duì)照組［13］。

(2)抑制炎癥反應(yīng):BDNF 不僅減少局部促炎癥因子，也增加局部抗炎癥因子。給予外源性的BDNF下調(diào)腦組織TNF-α 蛋白及其mRNA 的水平，上調(diào)IL-10 和其mRNA 的水平?？梢夿DNF 可以通過抑制炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用［14］。

(3)修復(fù)神經(jīng)元損傷，促進(jìn)神經(jīng)元再生:神經(jīng)元和軸突損傷后局部BDNF 蛋白表達(dá)不僅能刺激軸突發(fā)育和突觸形成，而且BDNF、成纖維細(xì)胞生長因子和神經(jīng)生長因子能提高內(nèi)皮細(xì)胞的分離和分化，并刺激血管生成，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能修復(fù)［15］。

(4)拮抗興奮性氨基酸(EAA)毒性:BDNF 可以減少NMDA 受體亞單位基因表達(dá)，下調(diào)NMDA 受體功能，降低谷氨酸的毒性［16］。

(5)有利于認(rèn)知和記憶能力:急性腦損傷的小鼠在上調(diào)海馬區(qū)BDNF 表達(dá)后，認(rèn)知能力明顯改善［17］。

腦缺血后，早期即可以引起B(yǎng)DNF 表達(dá)增多，這種變化是神經(jīng)細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過這種機(jī)制減輕損傷程度，并促進(jìn)后期神經(jīng)功能的恢復(fù)，但是這種自我保護(hù)能力是有限的。直接由靜脈給予外源性BDNF，由于BDNF 難以通過血腦屏障，未能有效發(fā)揮腦保護(hù)作用［18］。因此，用藥物增加內(nèi)源性BDNF 以發(fā)揮腦保護(hù)作用，成為研究、開發(fā)腦缺血保護(hù)藥物的途徑之一。

經(jīng)嗅覺系統(tǒng)進(jìn)入腦通路可能成為中樞系統(tǒng)藥物直接作用于大腦的新途徑。前期進(jìn)行的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為此提供了有力的證據(jù)。神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丁香酚的吸嗅能夠起到改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用［5，6］，對(duì)抑郁癥模型小鼠丁香酚吸嗅可以緩解的抑郁樣行為［19］。從嗅覺的工作機(jī)制可知，丁香酚與嗅覺受體的結(jié)合是芳香分子與受體特異性結(jié)合，所產(chǎn)生的嗅覺信號(hào)通過特異性的嗅覺通路被傳送至腦的嗅覺相關(guān)區(qū)域。丁香酚本身并不直接進(jìn)入腦組織，且嗅覺信號(hào)在傳遞的過程中有特異性、高敏感性、可飽和性、級(jí)聯(lián)放大等特點(diǎn)。所以相比于現(xiàn)在臨床常用藥物丁香酚吸嗅給藥方法安全性高、給藥方便經(jīng)濟(jì)，患者依從性好。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丁香酚吸嗅組的BDNF 表達(dá)顯著高于模型組。證明丁香酚吸嗅用來緩解腦缺血后損傷的癥狀是可行的，可以改善缺血后的認(rèn)知記憶能力等行為學(xué)指標(biāo)，可能是通過上調(diào)腦內(nèi)BDNF 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腦區(qū)功能，改善缺血后損傷。

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