亓法英　王富敏　于繼徐　車峰遠(yuǎn)　趙孔波

(山東省臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,*急救中心，山東臨沂　276003)

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·論著·

G93A突變的hSOD1基因?qū)rf2/ARE信號(hào)通路的影響

亓法英王富敏于繼徐車峰遠(yuǎn)趙孔波*

(山東省臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,*急救中心，山東臨沂276003)

摘要目的： 探討G93A突變的hSOD1 (human Cu/Zn superoxide dismutase) 基因在肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型NSC-34細(xì)胞中對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響。方法：將構(gòu)建好的質(zhì)粒hSOD1-pcDNA3.1(-)、hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染至肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型NSC-34細(xì)胞內(nèi)，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為4組：正常組、空轉(zhuǎn)組、野生組和突變組。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量來(lái)判斷細(xì)胞氧化損傷的程度；檢測(cè)線粒體膜通透性；通過(guò)Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、抗氧化酶的蛋白表達(dá)水平，以反映Nrf2/ARE信號(hào)通路在各組的活化程度。結(jié)果：轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)的NSC-34細(xì)胞(突變組)內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，同時(shí)線粒體通透性增加，提示線粒體受損傷；且Nrf2以及Nrf2/ARE信號(hào)通路下游效應(yīng)分子血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)和NAD(P)H醌氧化還原酶-1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。突變組細(xì)胞胞漿中Nrf2表達(dá)明顯減少(P<0.05)，而突變組和野生組細(xì)胞核中Nrf2增多，突變組細(xì)胞更為顯著(P<0.05)。結(jié)論：hSOD1基因的G93A突變使細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路受損，降低了細(xì)胞的抗氧化能力，加重了線粒體損傷。

關(guān)鍵詞肌萎縮側(cè)索硬化；NSC-34細(xì)胞；Nrf2/ARE通路

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種選擇性侵犯上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的慢性致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的肌肉無(wú)力、萎縮、肌束震顫、腱反射亢進(jìn)和病理征陽(yáng)性。ALS患者中，90%~95%為散發(fā)病例，5%~10%的患者有家族史。目前，ALS的發(fā)病機(jī)制不明，缺乏有效的治療方法，患者多于發(fā)病3~5年后死于呼吸肌麻痹[1-2]。

目前認(rèn)為，ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性丟失是由一系列復(fù)雜的相互作用機(jī)制所致。這些機(jī)制包括氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體功能障礙、細(xì)胞骨架異常、蛋白聚集以及遺傳因素等，其中，氧化應(yīng)激是其主要因素[3]。有研究[4-5]在約20%的家族性ALS患者中發(fā)現(xiàn)了銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)的突變；轉(zhuǎn)染突變的人類SOD1基因的小鼠可以表現(xiàn)出ALS樣癥狀。然而，迄今為止，對(duì)于病因已經(jīng)明確的轉(zhuǎn)染突變的人類SOD1基因的動(dòng)物毒性致病機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)編碼抗氧化酶和抗氧化蛋白(包括醌氧化還原酶1和血紅素氧合酶)，這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在不同的組織和器官中，Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活能夠保護(hù)機(jī)體或者減少細(xì)胞損傷。但是，關(guān)于Nrf2/ARE信號(hào)通路在ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮的作用目前仍未完全闡明。

NSC-34細(xì)胞模型在國(guó)外已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于ALS的研究[8-9]。本研究應(yīng)用NSC-34細(xì)胞構(gòu)建的ALS細(xì)胞模型，觀察G93A突變的人SOD1基因(human SOD1-G93A, hSOD1-G93A)對(duì)NSC-34細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化通路Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，以探討ALS的發(fā)病機(jī)制，為ALS治療藥物的篩選和治療提供更多的依據(jù)。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

NSC-34細(xì)胞系由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-pcDNA3.1(-)、hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；NAD(P)H醌氧化還原酶-1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]多克隆抗體、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)多克隆抗體、核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；總蛋白提取試劑盒、胞漿/胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇省南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共分為4組：正常NSC-34細(xì)胞(正常組)、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(空轉(zhuǎn)組)；轉(zhuǎn)染hSOD1-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(野生組)；轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(突變組)，均為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將4種細(xì)胞系從液氮中取出，置于37℃水浴箱中迅速融化，然后轉(zhuǎn)移至25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基并混勻，將培養(yǎng)瓶蓋旋至半松狀態(tài)，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；接種4~6 h后更換培養(yǎng)液，之后每 2~3 更換一次培養(yǎng)液。NSC-34細(xì)胞的免疫組化(anti-SIM2抗體，ab94630，英國(guó)Abcam公司)圖見(jiàn)圖1。

圖1NSC-34細(xì)胞的免疫組化圖片(anti-SIM2染色)

1.2.2細(xì)胞丙二醛檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量來(lái)反應(yīng)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的水平。在過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。根據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，在室溫下將各組細(xì)胞破碎并與反應(yīng)液混合，于95℃水浴箱內(nèi)水浴40 min，然后迅速用流水冷卻。加入96孔板內(nèi)，測(cè)定其在523 nm處的吸光度。

1.2.3蛋白質(zhì)的提取及濃度測(cè)定當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時(shí)，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，0.25%胰酶消化，1000 r/min、4℃離心10 min。細(xì)胞總蛋白的提取按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白的提取按照胞漿/胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4Western blotting檢測(cè)蛋白水平取60 μg蛋白，用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠、80 V電泳約30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)過(guò)了積層膠后，改用100 V電泳至溴酚藍(lán)達(dá)底部。電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，參數(shù)為300 mA、2 h。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗：鼠來(lái)源單克隆β-actin抗體(1∶500)、兔來(lái)源多克隆Nrf2抗體(1∶200)、兔來(lái)源多克隆HO-1抗體(1∶200)、羊來(lái)源多克隆NQO1抗體(1∶200)，4℃過(guò)夜。次日，用TBST(Tris buffered saline with Tween-20, PH 7.4)洗滌后加相應(yīng)的熒光二抗(β-actin二抗為1∶10000，其余均為1∶3000)，室溫孵育1 h， TBST(PH 7.4)洗滌，加ECL發(fā)光液后壓片、曝光。最后用成像儀掃描目的條帶，計(jì)算目的蛋白熒光條帶密度與相應(yīng)β-actin熒光條帶密度的比值。

1.2.5線粒體通透性的檢測(cè)采用線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔檢測(cè)試劑盒mitoprobeTMtransition pore assay kit (美國(guó)invitrogen公司)。將1 mmol/L的calcein-AM儲(chǔ)存液稀釋為濃度為2 μmol/L的工作液，即按照1∶500的比例用HBSS/Ca2+溶液稀釋。設(shè)置陰性對(duì)照組、線粒體攝入calcein-AM的對(duì)照組以及背景強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照組。向6孔板培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)加入2 μmol/L的calcein工作液5 μL，背景強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照組內(nèi)加入離子霉素(ionomysin)和CoCl2各 5 μL，其余各個(gè)組內(nèi)再加入CoCl25 μL(包括線粒體對(duì)照管)，37℃孵育15 min，加入HBSS/Ca2+溶液清洗，1 h內(nèi)完成熒光定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)過(guò)表達(dá)可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(突變組)中MDA的含量明顯高于其他3組細(xì)胞(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)的NSC-34細(xì)胞(空轉(zhuǎn)組)和轉(zhuǎn)染hSOD1-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(野生組)與正常的NSC-34細(xì)胞(正常組)相比，細(xì)胞內(nèi)MDA的含量沒(méi)有明顯差異。見(jiàn)表1。

表1　4組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量

注：與正常組、空轉(zhuǎn)組和野生組比較，*P<0.05

2.2hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)過(guò)表達(dá)可以明顯增加細(xì)胞漿內(nèi)線粒體膜的通透性在轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞(突變組)中，細(xì)胞漿線粒體內(nèi)calcein熒光強(qiáng)度較正常組、空轉(zhuǎn)組及野生組顯著下降，提示突變組中線粒體通透性增加(P<0.05)。野生組與空轉(zhuǎn)組的NSC-34細(xì)胞線粒體內(nèi)Calcein熒光強(qiáng)度與正常組NSC-34細(xì)胞相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示野生組及空轉(zhuǎn)組中沒(méi)有明顯的線粒體通透性改變。見(jiàn)圖2。

2.3hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)過(guò)表達(dá)可以下調(diào)Nrf2以及HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的 NSC-34 細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)總Nrf2以及HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)均低于正常組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染hSOD1-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞與正常NSC-34細(xì)胞相比，Nrf2及HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)過(guò)表達(dá)可以下調(diào)胞漿Nrf2的表達(dá)水平并增加Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)位突變組細(xì)胞胞漿中Nrf2蛋白的表達(dá)與其他3組細(xì)胞相比明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3，而其他3組細(xì)胞胞漿中Nrf2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。野生組和突變組細(xì)胞胞核中Nrf2蛋白與其他兩組相比明顯增加，且突變組細(xì)胞更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖2hSOD1-G93A對(duì)線粒體膜通透性的影響

圖3　hSOD1-G93A對(duì)Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)的影響

圖4　4組細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2蛋白水平的變化

3討論

家族性ALS患者中約20%有SOD1基因突變，把hSOD1-G93A轉(zhuǎn)染入小鼠中，可以使小鼠出現(xiàn)ALS神經(jīng)系統(tǒng)樣癥狀。為了研究hSOD1-G93A基因的致病機(jī)制，我們應(yīng)用NSC-34細(xì)胞過(guò)表達(dá)hSOD1-G93A基因，觀察hSOD1-G93A基因過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hSOD1-G93A過(guò)表達(dá)可以顯著增加MDA的水平，提示hSOD1-G93A過(guò)表達(dá)可以抑制NSC-34細(xì)胞的抗氧化和解毒能力。同時(shí)，hSOD1-G93A過(guò)表達(dá)可以使線粒體通透性顯著增加。已有研究[10]表明，線粒體通透性的增加與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)，線粒體膜通透性的增加可以使線粒體內(nèi)膜中的凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis induce factor，AIF)、caspase-3等釋放入胞漿并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)的NSC-34細(xì)胞內(nèi)，抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)蛋白Nrf2的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，與之相對(duì)應(yīng)，Nrf2-ARE信號(hào)通路下游效應(yīng)因子HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)水平也明顯低于正常對(duì)照組。在正常狀態(tài)下，Nrf2在細(xì)胞漿中與其抑制性蛋白Keapl(Kelch-like ECH-associated protein-1)相結(jié)合，處于非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，在氧自由基等的作用下，Nrf2與Keapl蛋白分離，Nrf2由胞漿轉(zhuǎn)位到胞核內(nèi)，通過(guò)與核內(nèi)ARE順式作用元件相結(jié)合來(lái)上調(diào)Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白(包括HO-1和NQO1)的表達(dá)[11-13]。HO-1被認(rèn)為在內(nèi)源性抗氧化防御過(guò)程中起重要作用，因?yàn)樵贖O-1基因敲除鼠模型中，細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激的損傷[14]。NQO1是一種電子還原酶，它能夠催化醌類及其衍生物發(fā)生還原反應(yīng)，且反應(yīng)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生單電子還原產(chǎn)物半醌及自由基等氧化產(chǎn)物，這有益于抵御機(jī)體代謝引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究[15]表明，破壞Nrf2分子及其下游信號(hào)通路會(huì)加重細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷、炎性反應(yīng)和線粒體功能障礙。Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑可以通過(guò)Nrf2/ARE通路上調(diào)HO-1的表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的損傷。以上證據(jù)表明，Nrf2/ARE信號(hào)通路可以對(duì)抗氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元。但是，在突變組NSC-34細(xì)胞中Nrf2/ARE信號(hào)通路受損，Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)下降，因此，突變組NSC-34細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步了解Nrf2/ARE信號(hào)通路的改變，我們分別檢測(cè)了NSC-34細(xì)胞漿和細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變組細(xì)胞胞漿中Nrf2的表達(dá)與其他3組細(xì)胞相比明顯減少，而正常組、空轉(zhuǎn)組和野生組細(xì)胞胞漿內(nèi)Nrf2的表達(dá)無(wú)明顯差異；野生組和突變組細(xì)胞核中Nrf2蛋白與其他兩組相比增加，而且突變組細(xì)胞增加更顯著(P<0.05)。以上結(jié)果與Mimoto等[16]在ALS動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的Nrf2積聚是一致的。有研究[17-18]在突變的TDP-43轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中也發(fā)現(xiàn)Nrf2核轉(zhuǎn)移，但是其下游抗氧化酶HO-1表達(dá)卻降低。也就是說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，突變組細(xì)胞中有更多的Nrf2由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，但是其下游的抗氧化酶的蛋白表達(dá)水平卻是降低的，這也說(shuō)明基因突變導(dǎo)致Nrf2/ARE信號(hào)通路受阻，使得下游效應(yīng)因子的表達(dá)不能相應(yīng)地增加。

綜上所述，在ALS模型中，hSOD1-G93A基因使細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路受損，降低了細(xì)胞的抗氧化能力。因此，Nrf2/ARE信號(hào)通路有潛力成為治療ALS的新靶點(diǎn)。

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基本項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)臨床專科建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：財(cái)社[2010]305號(hào))

Influences of hSOD1 Gene with G93A Mutation on Nrf2/ARE Signaling Pathway

QIFayingWANGFuminYUJixuCHEFengyuanZHAOKongbo*DepartmentofNeurology,*EmergencyCenter,LinyiPeople′sHospital,Linyi276003,China

AbstractObjective： To investigate the effect of human Cu/Zn superoxide dismutase (hSOD1) gene with G93A mutation on Nrf2/ARE signaling pathway in NSC-34 cell,the transgenic cell model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Methods： The established plasmids, hSOD1-pcDNA3.1(-), hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-), and pcDNA3.1(-) were transfected into NSC-34 cells, the transgenic cell model of amyotrophic lateral sclerosis. The models were divided into four groups according to different transfected plasmids. They were normal group, empty group, wild group and mutation group. The oxidative-stress injury was evaluated by detecting the content of intracellular malondialdehyde(MDA),a lipid peroxidation product. The permeability of mitochondrial membrane was detected. Western blotting was used to determine the intracellular protein expression level of Nrf2 and antioxidase, so as to reveal the activation level of the Nrf2/-ARE signaling pathway in each group. Results： The level of oxidative stress and the mitochondrial permeability increased in the NSC-34 cells transfected with human hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) gene(mutation group,P<0.05), which implied impairment of mitochondrias. The protein expression level of Nrf2, significantly decreased in NSC-34 cells transfected with hSOD1-G93A gene(P<0.05). So were heme oxygenase-1 (HO-1) and NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1), downstream effector molecules of Nrf2-ARE signaling pathway. The expression of Nrf 2 in cytoplasm significantly decreased in mutation group, while Nrf2 expression in cell nucleus significantly increased (P<0.05) in mutation group and wild group, especially in mutation group (P<0.05). Conclusions： The G93A mutation of hSOD1 gene impairs Nrf2/ARE signaling pathway in ALS cell models, reduces the antioxidant ability of cells, and increase the impairment of mitochondrias.

Key WordsAmyotrophic lateral sclerosis; NSC-34 cells;Nrf2/ARE signaling pathway

通訊作者張平安，E-mail：zhangpingan@aliyun.com

中圖分類號(hào)R34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A