陳宏武，王曙東，3

(1.鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院紡織服裝學(xué)院，江蘇 鹽城 224005;2.鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生態(tài)紡織研發(fā)工程中心，江蘇 鹽城 224005;3.蘇州大學(xué)紡織與服裝學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲的使用有上千年的歷史，因其產(chǎn)量豐富，有良好的力學(xué)性能、珍珠般的光澤、柔和的手感，享有纖維皇后的美譽(yù)［1－3］。蠶絲纖維主要由30%的絲膠蛋白和70%的絲素蛋白構(gòu)成，作為蠶絲纖維最主要的成分，絲素蛋白(又稱蠶絲蛋白)因其優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，良好的透氣透濕性，無(wú)毒、無(wú)刺激性和良好的力學(xué)性能［4－5］，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于絲蛋白支架材料的研究報(bào)道，如蠶絲蛋白凝膠［6］、蠶絲蛋白納米纖維［7］、蠶 絲 蛋白海綿支架［8］、蠶絲蛋白微球［9］、蠶絲蛋白粉末［10］、蠶絲蛋白膜［11］和蠶絲蛋白管［12］等，被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料［13］、藥物緩釋材料［14］、光子晶體材料［15］、電子器件［16］等領(lǐng)域。蠶絲蛋白水凝膠因其制備技術(shù)簡(jiǎn)單成熟，與細(xì)胞的親和性好，植入機(jī)體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，可生物降解易吸收等優(yōu)點(diǎn)，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者極大的興趣，并被廣泛應(yīng)用于各種機(jī)體組織的修復(fù)。

本文從蠶絲蛋白水凝膠的制備方法、蠶絲蛋白基水凝膠及其力學(xué)性能、凝膠成型機(jī)制、蠶絲蛋白水凝膠的快速成型等方面結(jié)合本課題組對(duì)蠶絲蛋白水凝膠的相關(guān)研究對(duì)蠶絲蛋白水凝膠的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 蠶絲蛋白水凝膠的制備方法

蠶絲蛋白水凝膠是由蠶絲蛋白水溶液通過(guò)不同的凝膠方法制備而成。而蠶絲蛋白水溶液的制備已非常成熟并不斷優(yōu)化，即蠶繭(或蠶絲)經(jīng)碳酸鈉(或碳酸氫鈉)脫膠去除絲膠后經(jīng)溶解體系溶解，用去離子水透析可制得蠶絲蛋白水溶液。常用的溶解體系為三元溶劑(乙醇-碳酸鈣-水)和溴化鋰水溶液。圖1示出采用溴化鋰溶解體系制備的蠶絲蛋白水溶液［17］。蠶絲蛋白水溶液經(jīng)旋流剪切、超聲振蕩、酸(離子液體或表面活性劑)處理、濃縮(或自然凝膠)、通過(guò)電流等可制備蠶絲蛋白水凝膠。

圖1 蠶絲蛋白水溶液的制備Fig.1 Preparation of silk fibroin solution and hydrogels

1.1 旋流剪切凝膠

旋流剪切凝膠方法較為簡(jiǎn)單，即采用渦旋振蕩器對(duì)絲蛋白溶液進(jìn)行高速的旋流剪切振蕩(如圖2所示)，振蕩后凝膠成為蠶絲蛋白水凝膠。Yucel等［18］采用旋流剪切凝膠的方法制備了蠶絲蛋白水凝膠，渦旋振蕩器的旋流剪切頻率為3200 r/min，研究了旋流剪切時(shí)間對(duì)蠶絲蛋白水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及凝膠黏彈性的影響。Rockwood等［17］認(rèn)為將蠶絲蛋白水溶液與細(xì)胞復(fù)合，可制備蠶絲蛋白細(xì)胞復(fù)合凝膠體系。

圖2 旋流剪切制備蠶絲蛋白凝膠Fig.2 Preparation of vortexed silk fibroin gels

1.2 超聲凝膠

超聲凝膠方法即采用超聲波振蕩器對(duì)蠶絲蛋白水溶液進(jìn)行處理。Wang等［19］采用功率為450W的超聲振蕩器對(duì)蠶絲蛋白水溶液進(jìn)行振蕩處理，獲得蠶絲蛋白水凝膠，并研究了超聲振蕩的凝膠機(jī)制以及蠶絲蛋白水凝膠的細(xì)胞親和性。Hu等［20］采用超聲振蕩法制備蠶絲蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠，并研究了復(fù)合凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物相容性。

1.3 酸凝膠

酸凝膠是將一些弱酸、離子液體、表面活性劑等化學(xué)試劑加入到蠶絲蛋白水溶液中以改變蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使蠶絲蛋白水溶液凝膠。Yucel等［21］向質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.3%的蠶絲蛋白水溶液中滴入稀釋的鹽酸溶液以調(diào)整蠶絲蛋白水溶液的pH值，達(dá)到制備蠶絲蛋白水凝膠的目的，研究了pH值對(duì)蠶絲蛋白水凝膠黏彈性的影響和酸凝膠機(jī)制，比較了幾種常見(jiàn)凝膠方法對(duì)蠶絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。Silva等［22］采用向蠶絲蛋白基水溶液滴加離子液體的方法，制備了殼聚糖/蠶絲蛋白復(fù)合水凝膠，研究了離子液體加入量對(duì)復(fù)合凝膠體系二級(jí)結(jié)構(gòu)和黏彈性的影響。Wu等［23］向蠶絲蛋白水溶液中加入十二烷基硫酸鈉，使得蠶絲蛋白快速凝膠，并著重研究了該方法的凝膠機(jī)制。

1.4 濃縮凝膠和自然凝膠

濃縮凝膠是將一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)(通常為3% ～8%)的蠶絲蛋白水溶液置于再生纖維素透析袋中，然后將該透析袋置于聚乙二醇的水溶液中，使得聚乙二醇溶液從蠶絲蛋白水溶液中不斷進(jìn)行吸水，蠶絲蛋白水溶液不斷濃縮以達(dá)到凝膠的目的，凝膠時(shí)間通常要1～2 d。自然凝膠是將蠶絲蛋白水溶液置于流通的空氣中或置于冰箱保鮮層中一段時(shí)間后自行凝膠的現(xiàn)象，但是自然凝膠通常需要1個(gè)月以上的時(shí)間。這種方法存在凝膠周期長(zhǎng)、凝膠質(zhì)量較差的問(wèn)題，作為生物醫(yī)用材料的蠶絲蛋白水凝膠不宜采用該種方法。

1.5 電凝膠

電凝膠是將直流電源(通常為15～30 V)的正負(fù)極通入蠶絲蛋白水凝膠中，蠶絲蛋白水凝膠會(huì)逐漸集聚到直流電源的正極。圖3示出采用30 V的直流電源通入蠶絲蛋白水溶液中的集聚現(xiàn)象。由圖可見(jiàn)，在直流電源的正極(石墨板)逐漸集聚一層蠶絲蛋白水凝膠，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶絲蛋白水凝膠逐漸增大。

圖3 蠶絲蛋白電凝膠Fig.3 Preparation of silk fibroin electrogels

Leisk等［24］研究表明采用電凝膠制備蠶絲蛋白水凝膠是一個(gè)可逆的過(guò)程(如圖4所示)，即當(dāng)交換通入電源的正負(fù)極時(shí)，原集聚在電源正極的蠶絲蛋白水凝膠逐漸消失，但又不斷地積聚到新的電源正極(原負(fù)極)上。

圖4 蠶絲蛋白電凝膠的可逆現(xiàn)象Fig.4 Reversible phenomenon in process of silk fibroin electrogel

綜上所述，制備蠶絲蛋白水凝膠的方法多種多樣，旋流剪切凝膠和超聲凝膠會(huì)在一定程度上破壞蠶絲蛋白大分子結(jié)構(gòu);酸、離子液體、表面活性劑的加入也會(huì)在一定程度上影響蠶絲蛋白水凝膠的生物相容性;濃縮凝膠的時(shí)間較長(zhǎng);電凝膠方法簡(jiǎn)單、效率較高，不破壞蠶絲蛋白大分子結(jié)構(gòu)、不影響蠶絲蛋白生物相容性，且存在可逆現(xiàn)象，因此本文認(rèn)為電凝膠是制備蠶絲蛋白水凝膠的理想方法。

2 蠶絲蛋白水凝膠形成機(jī)制

Kim等［25］研究表明蠶絲蛋白水凝膠的形成機(jī)制是由于蠶絲蛋白大分子鏈相互之間存在作用力，這些作用力主要包含疏水基團(tuán)之間的相互作用力和氫鍵等相互作用力。當(dāng)受到外界因素(電場(chǎng)、超聲、酸等)作用時(shí)，蠶絲蛋白分子鏈之間更易形成相互作用力，導(dǎo)致蠶絲蛋白大分子鏈之間形成物理交聯(lián)，生成蠶絲蛋白凝膠。Lu等［26］研究了蠶絲蛋白水凝膠的電凝膠機(jī)制，研究結(jié)果表明正常狀態(tài)下蠶絲蛋白水溶液中蠶絲蛋白無(wú)規(guī)卷曲部分的負(fù)電荷在蠶絲蛋白大分子鏈中占據(jù)主導(dǎo)地位，溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)，分子間相互排斥阻止了分子間相互作用形成β折疊結(jié)構(gòu)(如圖5所示)。此時(shí)蠶絲蛋白呈溶液狀態(tài)。當(dāng)給蠶絲蛋白水溶液施加電場(chǎng)后，蠶絲蛋白水溶液中的電源正極附近的質(zhì)子濃度逐漸增加，導(dǎo)致該區(qū)域的pH值小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蠶絲蛋白大分子鏈之間相互作用形成β折疊結(jié)構(gòu)，并逐漸交聯(lián)形成蠶絲蛋白膠束(微球)。蠶絲蛋白膠束(微球)的形貌如圖6所示。

圖5 蠶絲蛋白水凝膠形成機(jī)制示意圖Fig.5 Mechanism of electrogels of silk fibroin

圖6 蠶絲蛋白膠束(微球)的形貌結(jié)構(gòu)Fig.6 Morphology of silk fibroin micelle.(a)SEM image of silk fibroin micelle;(b)AFM image of silk fibroin micelle

蠶絲蛋白膠束的數(shù)量不斷增加，逐漸形成了蠶絲蛋白水凝膠。Wang等［19］研究了蠶絲蛋白水凝膠超聲凝膠機(jī)制，如圖7所示。研究結(jié)果表明由于超聲波振蕩導(dǎo)致蠶絲蛋白大分子鏈中的β折疊結(jié)構(gòu)(疏水基團(tuán)之間的相互作用)逐漸增加并相互交聯(lián)逐漸形成蠶絲蛋白水凝膠。

圖7 蠶絲蛋白水凝膠的超聲凝膠機(jī)制Fig.7 Mechanism of ultrasonic-induced silk fibroin gel

綜上所述，無(wú)論是哪種方法制備的蠶絲蛋白水凝膠，其主要機(jī)制均是通過(guò)蠶絲蛋白大分子之間相互作用形成β折疊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蠶絲大分子鏈之間相互糾纏、集聚，形成蠶絲蛋白微球膠束，隨著為微球膠束的集聚逐漸形成凝膠。

3 蠶絲蛋白復(fù)合水凝膠

蠶絲蛋白具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，但也存在材料力學(xué)性能差，凝膠質(zhì)量低，效率低，對(duì)骨支架修復(fù)存在缺陷，抗菌性能差，吸水(保水)性差(親水性差)等缺陷，為改善這些缺陷，研究人員常采用一些功能性納米材料或功能性高聚物材料對(duì)蠶絲蛋白水凝膠進(jìn)行改性(如表1所示)。

Huang等［27］將氧化石墨烯共混加入蠶絲蛋白中制備了蠶絲蛋白/氧化石墨烯復(fù)合凝膠體系，研究結(jié)果表明氧化石墨烯的共混極大地增加了蠶絲蛋白水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，控制適當(dāng)?shù)难趸┕不毂壤梢允箯?fù)合凝膠體系的斷裂強(qiáng)度增加至純絲蛋白凝膠的5倍。Huang等［28］采用旋流剪切法制備了蠶絲蛋白/聚氨酯復(fù)合水凝膠，研究結(jié)果表明聚氨酯與蠶絲蛋白具有良好的相容性，且聚氨酯的共混改善了蠶絲蛋白硬脆的特性，復(fù)合凝膠體系的柔性有了較大的改善。

Gong等［29］采用超聲法制備了蠶絲蛋白/羥基纖維素復(fù)合凝膠體系，羥基纖維素的混入改善了凝膠質(zhì)量，縮短了凝膠時(shí)間。Kojic等［30］在蠶絲蛋白水凝膠中摻雜金納米粒子，研究結(jié)果表明摻雜了金納米粒子的蠶絲蛋白水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能，用于組織修復(fù)時(shí)可避免細(xì)菌感染。Kim等［31］和Ming等［32］將羥基磷灰石與蠶絲蛋白復(fù)合制備蠶絲蛋白/羥基磷灰石復(fù)合水凝膠體系，研究結(jié)果表明羥基磷灰石的共混有效地模擬了骨的成分，更利于骨細(xì)胞的培養(yǎng)。Vasconcelos等［33］將彈性蛋白共混至蠶絲蛋白水凝膠中促進(jìn)了傷口的愈合。Mandal等［34］制備了蠶絲蛋白/聚丙烯酰胺復(fù)合水凝膠，聚丙烯酰胺的復(fù)合改善了凝膠體系的親水性，更加有利于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。Hu等［20］采用超聲法制備了蠶絲蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，研究結(jié)果表明透明質(zhì)酸的共混增加了材料的吸水保水性，提高了凝膠的蓬潤(rùn)性。

表1 高分子材料復(fù)合對(duì)蠶絲蛋白水凝膠的修飾改性Tab.1 Modification of silk fibroin hydrogels by blending of polymers

綜上所述，因蠶絲蛋白本身固有的缺陷，單純的蠶絲蛋白水凝膠支架應(yīng)用于生物醫(yī)用材料常常受到限制，因此將蠶絲蛋白水凝膠與一種乃至多種功能性材料復(fù)合是目前以及今后的研究趨勢(shì)。

4 蠶絲蛋白水凝膠的力學(xué)性能

作為生物醫(yī)用支架材料需擁有良好的力學(xué)性能，因此蠶絲蛋白水凝膠的力學(xué)性能是在制備蠶絲蛋白水凝膠及其應(yīng)用過(guò)程中需著重考慮的問(wèn)題。Leisk等［24］研究表明蠶絲蛋白水凝膠較蠶絲蛋白水溶液具有較高的強(qiáng)度和模量，但是由于蠶絲蛋白水凝膠力學(xué)強(qiáng)度差、硬脆等問(wèn)題，極大的限制了蠶絲蛋白水凝膠的應(yīng)用;因此有必要通過(guò)一些物理、化學(xué)等方法改善蠶絲蛋白水凝膠的力學(xué)性能。

Huang等［27］將功能材料氧化石墨烯共混至蠶絲蛋白水凝膠體系中，研究結(jié)果表明控制適當(dāng)?shù)难趸┕不毂壤梢猿杀兜卦黾有Q絲蛋白水凝膠的斷裂強(qiáng)度。Ghosh等［35］將制備的蠶絲蛋白水凝膠置于采用有機(jī)醇(甲醇)處理，研究結(jié)果表明，有機(jī)醇處理同樣可以成倍地增加蠶絲蛋白水凝膠的力學(xué)性能。

綜上所述，雖然蠶絲蛋白水凝膠較蠶絲蛋白水溶液的力學(xué)性能有較大的改善，但仍需通過(guò)一定的物理或化學(xué)方法進(jìn)行改善，才能更好地應(yīng)用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

5 蠶絲蛋白水凝膠快速成型研究

蠶絲蛋白水凝膠作為組織工程之家修復(fù)材料需要有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、優(yōu)異的力學(xué)性能，上述方法制備的蠶絲蛋白水凝膠存在凝膠成型慢，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問(wèn)題，因此需要通過(guò)特定的快速成型方法來(lái)提高蠶絲蛋白水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)蠶絲蛋白水凝膠快速成型方法主要有光固化、有機(jī)醇處理、環(huán)氧樹(shù)脂固化等。Kundu等［36］制備了蠶絲蛋白/聚乙烯醇復(fù)合水凝膠體系，并采用光敏引發(fā)劑Irgacure作為中間體，將凝膠體系置于紫外光燈下照射15 min，制備了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、成型較好的蠶絲蛋白水凝膠體系。Ghosh等［35］將制備的蠶絲蛋白水凝膠置于甲醇中處理，獲得了結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的蠶絲蛋白凝膠支架。

本文作者也開(kāi)展了蠶絲蛋白水凝膠快速成型的相關(guān)研究，采用電凝膠方法制備了蠶絲蛋白水凝膠體系，并用乙醇處理、紫外光固化等方法研究了蠶絲蛋白水凝膠的快速成型。本文采用流變儀測(cè)定了不同蠶絲蛋白體系的儲(chǔ)存模量和力學(xué)性能(反映了材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性)，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可見(jiàn)，蠶絲蛋白電凝膠的儲(chǔ)存模量要優(yōu)于蠶絲蛋白水溶液體系，而經(jīng)乙醇處理后(處理10 min)的蠶絲蛋白水凝膠的儲(chǔ)存模量明顯高于未經(jīng)處理的蠶絲蛋白水凝膠，表明經(jīng)乙醇處理后蠶絲蛋白水凝膠成型較好，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。而經(jīng)紫外光固化后(光固化1 min)的蠶絲蛋白凝膠體系的儲(chǔ)存模量要遠(yuǎn)高于蠶絲蛋白凝膠和經(jīng)乙醇處理后的凝膠體系，顯示出光固化蠶絲蛋白凝膠體系的成型較好、成型速度快且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖8 不同蠶絲蛋白體系的儲(chǔ)存模量Fig.8 Storage modulus of different silk fibroin systems

圖9 不同蠶絲蛋白體系的力學(xué)性能Fig.9 Mechanical properties of different silk fibroin system

圖9示出不同蠶絲蛋白體系的力學(xué)性能。由圖可見(jiàn)，經(jīng)乙醇處理后的蠶絲蛋白凝膠體系的斷裂強(qiáng)度為6.5 MPa，較未經(jīng)處理蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強(qiáng)度(3.2 MPa)增加了1倍以上，表明經(jīng)乙醇處理后蠶絲蛋白水凝膠成型較好，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。而經(jīng)紫外光固化后的蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強(qiáng)度達(dá)到7.8 MPa，較未經(jīng)處理的蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強(qiáng)度增加了2倍以上，同樣顯示出光固化蠶絲蛋白凝膠體系的成型較好、成型速度快且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

綜合文獻(xiàn)分析，蠶絲蛋白水凝膠體系存在制備效率較低、結(jié)構(gòu)(性能)不可控、工序繁瑣、費(fèi)用高昂等缺點(diǎn)，將蠶絲蛋白水凝膠復(fù)合體系與當(dāng)前熱門(mén)的三維生物打印技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)三維生物打印蠶絲蛋白水凝膠，制備結(jié)構(gòu)、尺寸、材料組分可控的蠶絲蛋白水凝膠生物支架材料。主要對(duì)蠶絲蛋白水凝膠在打印過(guò)程中的快速凝膠成型機(jī)制進(jìn)行研究，著重解決打印過(guò)程中凝膠、結(jié)構(gòu)、尺寸、組分以及表面生物兼容性控制與三維打印技術(shù)的集成等難點(diǎn)。

6 結(jié)語(yǔ)

采用對(duì)蠶絲蛋白水溶液旋流剪切、超聲振蕩、酸處理、濃縮、施加電場(chǎng)等方法可成功制備蠶絲蛋白水凝膠。采用一些功能性納米材料或功能性高聚物材料對(duì)蠶絲蛋白水凝膠進(jìn)行改性。蠶絲蛋白水凝膠的快速成型是蠶絲蛋白水凝膠應(yīng)用于組織修復(fù)的關(guān)鍵，可采用光固化、有機(jī)醇處理、環(huán)氧樹(shù)脂固化等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)蠶絲蛋白水凝膠的快速固化成型。本文詳細(xì)地介紹了蠶絲蛋白水凝膠的制備方法、凝膠機(jī)制、改性處理、快速成型方法，并結(jié)合目前本課題組三維生物打印蠶絲蛋白水凝膠制備結(jié)構(gòu)與性能可控的支架材料，為蠶絲蛋白水凝膠更廣泛的應(yīng)用于臨床提供了思路。

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