劉茂柯，唐玉明，趙 珂，任道群，姚萬(wàn)春，田新惠

1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所生物中心，瀘州 646100 2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，溫江 611130

濃香型白酒窖泥放線(xiàn)菌的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性

劉茂柯1,*，唐玉明1，趙 珂2，任道群1，姚萬(wàn)春1，田新惠1

1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所生物中心，瀘州 646100 2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，溫江 611130

以瀘州老窖1、50、100 和400 年窖泥為研究對(duì)象，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE) 研究濃香型白酒窖泥放線(xiàn)菌的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性。DGGE 圖譜顯示，除1 年樣品外，其余窖底泥多樣性指數(shù)(H) 均低于同窖齡窖壁泥，但均勻度指數(shù)(EH) 較高。不同窖池相同部位窖泥的群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)為：隨窖齡的延長(zhǎng)，窖壁泥H值逐漸上升，為1.74—2.28；窖底泥下降，為1.73—2.07。EH值均為波動(dòng)下降，分別在0.986—0.991 和0.971—0.994 之間。窖底泥相似性系數(shù)(SC) 逐漸上升，為0.46—0.82；窖壁泥為0.31—0.62。DGGE 條帶測(cè)序結(jié)果顯示，窖泥放線(xiàn)菌歸于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4 個(gè)屬。Olsenella和Atopobium屬為共有的優(yōu)勢(shì)屬，且在窖壁泥中的優(yōu)勢(shì)度(di) 均隨窖齡延長(zhǎng)而降低，在窖底泥中升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃香型白酒窖泥蘊(yùn)藏著豐富的放線(xiàn)菌資源，群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，菌群演替呈現(xiàn)一定規(guī)律性。

窖泥；放線(xiàn)菌；群落結(jié)構(gòu)；演替；變性梯度凝膠電泳

濃香型白酒深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，其釀造生產(chǎn)依靠窖泥微生物的協(xié)同作用[1]。揭示窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性可為釀酒功能微生物的系統(tǒng)選育，人工窖泥配方的優(yōu)化改良提供理論依據(jù)。放線(xiàn)菌是與人類(lèi)生活密切相關(guān)的一類(lèi)特殊細(xì)菌，其代謝產(chǎn)物一直是食品、醫(yī)學(xué)工業(yè)的研究熱點(diǎn)。已有研究顯示，放線(xiàn)菌可能促進(jìn)濃香型白酒主體香味物質(zhì)的形成[2]。但目前對(duì)窖泥放線(xiàn)菌的研究仍然較少，對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育、多樣性結(jié)構(gòu)亦鮮有報(bào)道。這必將弱化對(duì)濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理的正確認(rèn)識(shí)。

近年來(lái)，以PCR 為基礎(chǔ)的免培養(yǎng)技術(shù)已成為現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)研究的重要手段，在對(duì)極端環(huán)境群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)方面具有傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)勢(shì)[3]。因此，本研究采用PCR-DGGE 分析濃香型白酒窖泥放線(xiàn)菌的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，以期為相關(guān)研究的深入奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

瀘州老窖1、50、100 和400 年窖池的窖壁泥和窖底泥。窖壁泥取樣方法是從窖池四壁中心的一點(diǎn)各取50 g 窖泥，混合均勻。窖底泥為窖底四個(gè)角落和中心的一點(diǎn)各取50 g 窖泥，混合均勻。樣品冷凍密封保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥樣品預(yù)處理及總DNA 的提取

按黃永光等[4]的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理后提取總DNA。用DNA 純化試劑盒 (上海生工)純化總DNA 后，于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 放線(xiàn)菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增

首先采用引物F243 和R1378 進(jìn)行擴(kuò)增，再以PCR 產(chǎn)物的10 倍稀釋液為模板，使用F984-GC 和R1378 進(jìn)行嵌入式擴(kuò)增[5]。反應(yīng)體系(50 μL)：10×緩沖液2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 2 μL，BSA(25 mg/mL) 2.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足50 μL。兩輪PCR 程序相同，參照李小林等[6]的方法進(jìn)行。用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE 與測(cè)序

PCR 產(chǎn)物采用Bio-Rad 變性梯度凝膠電泳儀進(jìn)行分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍40%—70%。使用1×TAE 緩沖液，100 V 電泳10 min 進(jìn)膠，再在70 V、60 ℃ 條件下電泳12 h，銀染法染色[7]，最后用數(shù)碼相機(jī)照相。將DGGE 圖譜上的主要條帶切膠回收，用F984 和R1378[5]引物對(duì)片斷進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后克隆測(cè)序。

1.2.4 DGGE 圖譜分析

DGGE 圖譜用Quantity One 4.1.1 軟件(Bio-Rad) 分析，測(cè)定圖譜條帶數(shù)與光強(qiáng)度，計(jì)算條帶優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(di)、多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(EH) 和群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)(SC)[8]。

H=-∑Pi·lnPi(Pi=Ni/N)
EH=H/lnS
di=Pi=Ni/N

式中,Ni為DGGE 圖譜中條帶i的光強(qiáng)度；N為所有條帶的光強(qiáng)度之和；S為條帶數(shù)目。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將序列通過(guò)DNAMAN 進(jìn)行處理，用BLAST 將序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較，獲得相近模式菌株序列，用MEGA 5.0 中Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥放線(xiàn)菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增

圖1 窖泥放線(xiàn)菌16S rRNA 基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖譜 Fig.1 Electrophoresis graph of the amplified 16S rRNA fragments from pit mudM：DL2000 Marker；圖中數(shù)字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

窖泥總DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后獲得放線(xiàn)菌的16S rRNA 基因目的片斷，經(jīng)1% 瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到的片段大小約為400 bp (圖1)。

2.2 DGGE 圖譜

圖2 窖泥放線(xiàn)菌16S rRNA 基因片段的DGGE 圖譜 Fig.2 DGGE patterns of 16S rRNA gene extracted from Actinobacteria in the pit mudM：DL2000 Marker；圖中數(shù)字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

圖2為窖泥放線(xiàn)菌16S rRNA 基因片段的DGGE 圖譜。各樣品PCR 產(chǎn)物經(jīng)DGGE 分離后共得到17 條不同位置的條帶。B1—B10 為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序條帶。其中，B3、B5 和B10 為所有樣品共有，表明不同窖泥的主要條帶一致，放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)具有相似性。其余條帶為部分樣品所有，其中B9 僅在50a以上窖壁泥中檢出，B7、B8 在100a以上窖底泥中檢出，說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)因窖池窖齡和部位的不同而存在差異。這可能導(dǎo)致釀造白酒的酒質(zhì)不同。

2.3 優(yōu)勢(shì)度(di) 分析

優(yōu)勢(shì)度(di) 反映某物種在所有物種中所占的數(shù)量比例。結(jié)果顯示，DGGE 圖譜上每一條帶在不同樣品中的di值差異較大，但共有條帶B3、B5 和B10 的di值在不同樣品中均維持較高水平，表明它們代表窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)于窖壁泥樣品，以上條帶di值隨窖齡延長(zhǎng)而逐步降低；在窖底泥中，B3、B5 逐漸上升，B10 則表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)(圖3)。此結(jié)果揭示，窖泥放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)的演替可能具有一定的規(guī)律。

2.4 多樣性指數(shù)(H) 和均勻度指數(shù)(EH)

多樣性指數(shù)(H) 主要基于物種數(shù)量反映生態(tài)環(huán)境中的物種多樣性，均勻度指數(shù)(EH) 反映物種的分配情況。結(jié)果如圖4所示，不同樣品H和EH值存在一定差異。但同窖齡樣品中，除1a樣品外，其余窖底泥H值較低，EH值較高。不同窖齡樣品中，相對(duì)1 年窖壁泥(1.74)，50a窖壁泥H值(2.16) 有明顯上升，隨后上升程度減??；100 和400 年間無(wú)明顯變化，分別為2.28 和2.27。窖底泥H值則隨窖齡延長(zhǎng)而平穩(wěn)下降，維持在1.73—2.07 之間。另一方面，窖壁和窖底泥EH值均隨窖齡延長(zhǎng)而波動(dòng)下降，分別為0.986—0.991 和 0.971—0.994。窖底泥的波動(dòng)幅度較大，且以1到50年的變化最明顯。

圖3 不同窖齡窖泥主要條帶的優(yōu)勢(shì)度變化Fig.3 Changing laws of dominant degree of the main bands in the pit with different ages

圖4 不同窖齡窖泥的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù) Fig.4 Shannon-weaver index and evenness for the pit with different ages

此結(jié)果提示，在窖泥老熟過(guò)程中，窖壁泥放線(xiàn)菌主要表現(xiàn)為新種屬的生長(zhǎng)；窖底泥主要為原種屬的消亡。在此過(guò)程中，1到50年間放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大。

2.5 窖泥放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)相似性(SC) 分析

圖5 窖泥放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)相似性樹(shù)狀圖 Fig.5 Dendrogram of homology coefficient of Actinobacteria in the pit mudM：DL2000 Marker；圖中數(shù)字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)(SC) 反映不同樣品菌群種類(lèi)的相似程度。窖泥放線(xiàn)菌SC結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，當(dāng)SC值小于0.53，窖泥樣品分為3 個(gè)大族。3 號(hào)樣品單獨(dú)為一個(gè)族；2、4 和5 號(hào)為第二族，其余樣品為第三族。其中，窖底泥SC值較高，相近窖齡樣品SC值隨窖齡延長(zhǎng)而上升，為0.46—0.82；其次是窖壁泥，為0.31—0.62；同窖齡樣品SC值較低，為0.31—0.46。結(jié)果說(shuō)明，窖泥空間分布可能是影響放線(xiàn)菌種類(lèi)差異的主要原因。在窖泥老熟過(guò)程中，窖底泥菌群種類(lèi)逐漸穩(wěn)定。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

序列同源性結(jié)果顯示，序列B5、B9、B10 和最似模式菌株OlsenellaprofusaCCUG 45371T、CorynebacteriumminutissimumNCTC 10288T、AtopobiumparvulumVPI 0546T的同源性較低，分別為95%、90% 和93%。其余序列和最似模式菌株同源性為97%—100%。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖6 所示，所有序列大致聚為3個(gè)族。B1、B2、B4 與Streptomyces屬模式菌株聚在第1個(gè)族；B3、B5、B10和Olsenella屬以及Atopobium屬聚在第2個(gè)族，并以與Olsenella屬的同源性較高；其余序列與Corynebacterium屬聚在第3個(gè)族。結(jié)果顯示窖泥放線(xiàn)菌可歸屬于以上4 個(gè)屬，具有一定的多樣性。

圖6 部分放線(xiàn)菌DGGE 條帶系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of Actinobacteria from DGGE bands

3 討論

傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，放線(xiàn)菌在濃香型白酒釀造中的作用有限，使得相關(guān)研究一直未受重視。有關(guān)窖泥放線(xiàn)菌多樣性的研究?jī)H見(jiàn)于張超等[9]在2011 年的報(bào)道。他們采用平板法從多糧濃香型窖泥分離出Streptomyces、Massilia、Nocardiopsis3 個(gè)屬，其中以Streptomyces屬占優(yōu)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，主要原因可能與分析手段不同有關(guān)。在環(huán)境微生物的檢測(cè)中，往往需將可培養(yǎng)和免培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，以獲得更詳盡的科學(xué)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)和前人的研究互為補(bǔ)充，進(jìn)一步揭示出窖泥蘊(yùn)藏著豐富的放線(xiàn)菌資源，應(yīng)當(dāng)引起研究者足夠重視。其次，原因可能還與本實(shí)驗(yàn)樣品為單糧窖泥有關(guān)。單糧和多糧釀造采用的原料與工藝不同，但這是否會(huì)對(duì)群落結(jié)構(gòu)及多樣性造成影響有待證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1 到50年間放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，此后趨于穩(wěn)定。這與已報(bào)道的窖泥菌群結(jié)構(gòu)變化[10- 11]相似，表明窖泥微生物演替具有共性。羅惠波等[12]認(rèn)為，窖泥細(xì)菌菌群相似性以同窖齡樣品最高。同部位樣品的相似性較高，演替更顯規(guī)律性，說(shuō)明放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)和演替具有自身特殊性。放線(xiàn)菌的生物總量隨窖泥老熟而遞增[1]。這與本實(shí)驗(yàn)窖壁泥光強(qiáng)度總值(N) 變化一致。不同的是，窖底泥變化截然相反，這可能和放線(xiàn)菌的好氧特性有關(guān)。具體到某一種群，無(wú)論窖壁或窖底泥，N值變化均不明顯。由此可見(jiàn)，放線(xiàn)菌生物總量的變化主要受多樣性影響。

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的種屬中，Streptomyces屬為多數(shù)樣品共有。王濤等[2]的研究顯示，來(lái)源于釀造環(huán)境的Streptomyces屬放線(xiàn)菌可產(chǎn)生酯、酸、醛、酮和醇類(lèi)等濃香型白酒的香味物質(zhì)。他推測(cè)該種屬可能在釀造中扮演重要角色。Streptomyces屬在張超等[9]和本研究中均被檢出，說(shuō)明其在窖泥中穩(wěn)定存在，可能對(duì)濃香型白酒釀造具有普遍作用。此外，其余種屬作用尚無(wú)報(bào)道。優(yōu)勢(shì)屬Atopobium和Olsenella的主要生境是人體，兩者因親緣關(guān)系較近常被合并研究[13- 15]。它們存在于窖泥中有其合理性，并可能對(duì)釀造生產(chǎn)起到積極作用。首先，其專(zhuān)性厭氧特性與釀造環(huán)境相適應(yīng)，這可能是其在窖底泥的優(yōu)勢(shì)度不斷提高，同時(shí)也是未被張超等[9]分離到的原因之一；其次，代謝產(chǎn)物如乳酸，乙酸和丁酸等[15- 17]與濃香型白酒香味物質(zhì)密切相關(guān)；最后，一些菌種如A.parvulum、O.umbonata均具有硫化物分解能力[13, 15]，這可能起到預(yù)防窖泥老化板結(jié)的作用。另外，Corynebacterium屬主要來(lái)源于乳制品、蔬菜和土壤等生境[18]。岳元媛等[19]發(fā)現(xiàn)1573 窖底泥也有該種屬存在。本實(shí)驗(yàn)顯示，該種屬在50a以上窖泥中均可檢出，并以在窖底泥的豐度較高。同時(shí)，某些菌種如C.tuberculostearicum可能為100a以上的高齡窖底泥特有。雖然其作用尚不清楚，但這提示是否可從菌群的特有性來(lái)衡量窖泥老熟程度？這也是值得深入研究的課題。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用DGGE 技術(shù)初步解析了濃香型白酒窖泥放線(xiàn)菌的菌落結(jié)構(gòu)及其多樣性。結(jié)果表明，窖泥放線(xiàn)菌歸屬于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4 個(gè)屬。不同窖齡窖泥放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有一定差異，但同部位窖泥的菌群演替顯示出一定規(guī)律性。此結(jié)果有助于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)放線(xiàn)菌在濃香型白酒釀造中所扮演的角色，從中篩選一些功能菌種并加以利用可能對(duì)人工窖泥配方的優(yōu)化改良大有裨益。

本實(shí)驗(yàn)供試窖泥采自瀘州老窖不同年份窖池，釀造產(chǎn)品分別面向不同層次消費(fèi)市場(chǎng)，樣品來(lái)源具有代表性。由于窖泥樣品，尤其是高齡窖泥的稀有性，在今后工作中，應(yīng)加強(qiáng)樣品的收集，增加樣品的全面性，使研究結(jié)果具有更廣泛的適用性，以利于相關(guān)研究的深入發(fā)展。

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Analysis of actinobacteria community and diversity in the pit mud of chinese luzhou-flavour liquor

LIU Maoke1,*, TANG Yuming1, ZHAO Ke2, REN Daoqun1, YAO Wanchun1, TIAN Xinhui1

1BiotechlogyCenter,Rice&SorghumResearchInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Luzhou646100,China2CollegeofResourceandEnvironment,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China

In this study, the pit mud of Luzhou-flavour liquor which was used for 1, 50, 100 and 400 years were taken from a factory affiliated to the Luzhou Laojiao Group. Eight mixed samples were sampled from the wall and bottom layers of the pit mud in the cellars. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was employed to analyse actinobacteria community structure and diversity from the samples.For the analysis, 16S rRNA fragments about 400 bp amplified from DNA extracted from the eight mixed pit mud samples. Among all samples, ten stronger bands and few number of less intense bands were detected, only three stronger bands can be amplified from each sample, differences between the DGGE patterns of the different position of pit mud were also detected. On the whole, however, the community of the samples taken from the same position was comparatively similar, and a regular pattern was observed during the community succession. In the same cellar, except the sample used for about 1 year, the diversity index (H) of the wall-layer sample was much higher than the bottom -layer samples′, while the evenness index (EH) is opposite. In addition, with the increase of pit age, theHvalues of the wall-layer sample gradually increased from 1.74 to 2.28, and decreased from 2.07 to 1.73 in the bottom-layer sample. Meanwhile all samples showed a linear trend toward decrease in theEHvalues, and the variation ofEHvalues of the wall and the bottom layers were between 0.986 to 0.991 and 0.971 to 0.994, respectively. Moreover, the similarity coefficient (SC) between the bottom layer enhanced with the increasing pit age, ranging from 0.46 to 0.82, and theSCvalues of the bottom layer ranged from 0.31 to 0.62. The recovery of DGGE strip series showed the 16S rRNA gene sequence similarity between the ten stronger bands and the typical strains published in Genbank was 90% to 100%, and those sequences belonged to four genera (Olsenella,Atopobium,StreptomycesandCorynebacterium).The three stronger bands that can be amplified from each sample belonged toOlsenellaandAtopobium. With the increasing pit age, the dominant degree (di) of the three stronger bands in the wall-layer generally decreased, but increased in the bottom-layer. This result revealed the abundant diversity of actinobacteria in the pit mud of Chinese Luzhou-flavour liquor. The actinobacteria community structure and diversity were different among different samples, whereas the community succession is regular. To our knowledge, this was the first time the community and diversity of acinobacteria in pit mud were reported.

pit mud; actinobacteria; community; succession; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

四川省財(cái)政基因工程專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012QNJJ- 022); 四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程專(zhuān)項(xiàng)基金(2013- 018); 瀘州市科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(2012-S- 30)

2013- 04- 10;

日期:2014- 04- 03

10.5846/stxb201304100664

*通訊作者Corresponding author.E-mail: liumaoke 0307@163.com

劉茂柯，唐玉明，趙珂，任道群，姚萬(wàn)春，田新惠.濃香型白酒窖泥放線(xiàn)菌的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(3):858- 864.

Liu M K, Tang Y M, Zhao K, Ren D Q, Yao W C, Tian X H.Analysis of actinobacteria community and diversity in the pit mud of chinese luzhou-flavour liquor.Acta Ecologica Sinica,2015,35(3):858- 864.