孟賢靜，呂 全,*，劉學(xué)偉，焦相杰，梁 軍，張星耀

1 國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091 2 內(nèi)蒙古赤峰市克什克騰旗廣興林場，赤峰 025350

落葉松八齒小蠹與長喙殼真菌間的種特異性伴生關(guān)系

孟賢靜1，呂 全1,*，劉學(xué)偉1，焦相杰2，梁 軍1，張星耀1

1 國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091 2 內(nèi)蒙古赤峰市克什克騰旗廣興林場，赤峰 025350

小蠹蟲與長喙殼類真菌(Ophiostomatoid fungi)在自然界中形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，是森林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)一種普遍的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象。已有研究表明歐亞大陸的齒小蠹屬(Ips)昆蟲與多種長喙殼類真菌形成廣泛的伴生關(guān)系，其中部分真菌是重要的針葉樹病原菌。隨著借助于DNA信息特征的系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示出形態(tài)特征和親緣關(guān)系十分接近的3種齒小蠹屬昆蟲，云杉八齒小蠹(I.typographus)，歐洲落葉松八齒小蠹(I.cembrae)和亞洲落葉松八齒小蠹(I.subelongatus)確定為不同種之后，相應(yīng)地與之穩(wěn)定伴生的長喙殼類真菌Ceratocystispolonica也由過去一個種揭示為3個種的復(fù)合體，各自與3種小蠹蟲穩(wěn)定伴生，形成密切的種特異性伴生關(guān)系。小蠹蟲與真菌的種特異性伴生被認(rèn)為是處于同一森林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的生物協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。通過對我國東北地區(qū)落葉松八齒小蠹蟲體、坑道標(biāo)本上伴生真菌菌株的采集、分離和生理學(xué)、形態(tài)學(xué)特征觀察，以及基于ITS、β-tubulin、MAT- 2 HMG box多位點(diǎn)DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，首次確定了長喙殼真菌Ceratocystisfujiensis在我國東北地區(qū)異域分布的3種落葉松林內(nèi)普遍存在，與落葉松八齒小蠹形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系。作為亞洲落葉松八齒小蠹伴生的主要真菌，也是伴生菌區(qū)系中的先鋒種和致病力最強(qiáng)的病原菌，C.fujiensis在我國落葉松人工林的廣泛分布值得高度重視，將為制定防治病蟲復(fù)合危害的有效策略和措施提供科學(xué)基礎(chǔ)。研究結(jié)果進(jìn)一步支持了齒小蠹屬昆蟲與長喙殼真菌間的種特異性伴生假說。同時(shí)，多基因序列特征表明落葉松八齒小蠹與C.fujiensis在亞洲范圍內(nèi)的不同地理種群存在著顯著的遺傳多樣性，預(yù)示特異性伴生在不同種群間發(fā)生的可能，可以為種特異性伴生假說和小蠹蟲-真菌間共生關(guān)系的研究提供良好的模式材料。

亞洲落葉松八齒小蠹;Ceratocystisfujiensis; 系統(tǒng)發(fā)育; 落葉松; 病原菌

落葉松屬植物(Larixspp.)作為落葉松八齒小蠹(Ipssubeolongatus)的主要寄主，是速生豐產(chǎn)用材林基地建設(shè)的首選樹種，在我國廣泛分布。然而，落葉松純林的大量營造為落葉松的廣泛分布和大量純林為落葉松八齒小蠹的發(fā)生和傳播蔓延提供了條件。目前發(fā)現(xiàn)，落葉松八齒小蠹在我國的地理分布范圍極廣[1]，主要危害東北和華北異域分布的興安落葉松(L.gmelini)、長白落葉松(L.olgensis)和華北落葉松(L.prineipis-rupprechtii)[2]。

落葉松八齒小蠹作為次期性害蟲的先鋒種，主要侵害伐倒木、瀕死木，發(fā)生盛期也可危害健康或衰弱的的活立木，給我國的落葉松人工林造成巨大的損失和威脅[3,4]，被列入“全國林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名單”(國家林業(yè)局2013年第4號公告)[5]，同時(shí)也是歐洲和地中海植物保護(hù)組織(EPPO)預(yù)警名單A2(http://www.eppo.org/QUARANTINE/listA2.htm)里的種類。

小蠹蟲和真菌之間的伴生是森林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)一種普遍的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象，是生物長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。伴生真菌，尤其是長喙殼類真菌(ophiostomatoid fungi)在與昆蟲形成廣義上的共生關(guān)系體內(nèi)，起到影響昆蟲種群建立、協(xié)同克服寄主抗性、引起樹木病害和造成木質(zhì)部變色的作用[6- 7]，帶來直接和間接的經(jīng)濟(jì)損失。長喙殼類真菌主要包括微囊目(Microascales)的長喙殼屬(Ceratocystis)、穴喙殼屬(Sphaeronaemella)、Gondwanamyces屬和Cornuvesica屬，以及蛇口殼目(Ophiostomatales)的蛇口殼屬(Ophiostoma)、Grosmannia屬和擬長喙殼屬(Ceratocystiopsis)，以及對應(yīng)于這些有性型的多種無性屬[8]。

自Hartig首次發(fā)現(xiàn)真菌與小蠹蟲的伴生現(xiàn)象以來[9]，二者之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系得到了越來越多的研究材料和個例的證實(shí)。小蠹蟲和真菌各自形成了特定的形態(tài)構(gòu)造以利于保持雙方共生體的延續(xù)，其中小蠹蟲體表形成的貯菌器(mycangium)是這種進(jìn)化最有力的證據(jù)[6]。

齒小蠹屬目前包括約36個種，全部分布于北半球的針葉林內(nèi)。其中13個種分布于歐亞大陸[10]。形態(tài)和親緣關(guān)系十分相似的3種齒小蠹，云杉八齒小蠹(Ipstypographus)、歐洲落葉松八齒小蠹(I.cembrae)和亞洲落葉松八齒小蠹(I.subelongatus)作為歐亞大陸針葉林內(nèi)的種類，引起了大范圍的危害。云杉八齒小蠹在歐洲被列為危害最為嚴(yán)重的十大蠹蟲之首[11]，目前發(fā)現(xiàn)與云杉八齒小蠹及其日本變種(I.typographusf.japonicus)相伴生的長喙殼真菌約有30種，其中形成穩(wěn)定伴生關(guān)系的主要是Ceratocystispolonica(Siem.) C. Moreau，是伴生菌區(qū)系中的先鋒種，往往在真菌侵染寄主的最前端分離率最高。Ceratocystispolonica是一種強(qiáng)致病性病原菌[12]，其致病性增強(qiáng)了害蟲的危害性[6,13]。

在歐洲目前發(fā)現(xiàn)11種長喙殼真菌與歐洲落葉松八齒小蠹伴生[6,14- 18]，其中與強(qiáng)致病性病原菌C.laricicola形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系。日本也較早開展了落葉松八齒小蠹伴生菌的研究[19]，到目前報(bào)道與12個長喙殼真菌的種類伴生[20- 22]。盡管最初認(rèn)為這兩種小蠹蟲屬同種，而且都可與病原菌C.laricicola穩(wěn)定伴生，但隨后借助DNA序列為工具的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究揭示了害蟲和伴生菌分屬兩個不同種，在日本與亞洲落葉松八齒小蠹伴生的主要真菌為Ceratocystisfujiensis[23]，而不是C.laricicola。

上述3種八齒小蠹形態(tài)極為相似，與此類似的是，3種小蠹蟲各自穩(wěn)定的伴生菌C.polonica、C.laricicola和C.fujiensis之間形態(tài)上也幾乎無法區(qū)別，但基于多基因序列分析的系統(tǒng)發(fā)育分析清晰的表明它們屬于不同種，而且它們也可以通過寄主、媒介昆蟲和地理區(qū)域的分化特征進(jìn)行區(qū)分[23]。即小蠹蟲與伴生真菌在長期協(xié)同進(jìn)化過程中，特定種的小蠹蟲只與特定種的真菌形成穩(wěn)定的“種特異性伴生”關(guān)系假說(species-specific association of fungi with bark beetles)[24- 26]。

我國近幾年也對落葉松八齒小蠹伴生菌有一些零星的研究和報(bào)道[27- 29]，但缺乏系統(tǒng)性。本研究通過對3種異域分布的落葉松林內(nèi)的齒小蠹伴生菌進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查和分析，期望驗(yàn)證種的特異性伴生假說，以明確穩(wěn)定伴生的長喙殼病原菌在我國森林生態(tài)系統(tǒng)中的分布范圍，為森林病蟲害的有效治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

于2011—2012年，分別在內(nèi)蒙古阿榮旗，根河，五岔溝，赤峰；黑龍江省古城，伊春；吉林長白，遼寧撫順等地區(qū)選擇興安落葉松、長白落葉松和華北落葉松進(jìn)行標(biāo)本采集。標(biāo)本包括落葉松八齒小蠹蟲體標(biāo)本與坑道標(biāo)本。

1.2 真菌分離純化

采用組織分離法進(jìn)行伴生真菌分離。將坑道標(biāo)本切成3 mm×3 mm大小的組織塊，用1.5%的次氯酸鈉溶液(每100 mL含1滴吐溫20)進(jìn)行表面消毒處理1 min，再用無菌水沖洗3次。無菌濾紙吸干組織塊上的水分后接于2%的無菌水瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)。利用1.5%的次氯酸鈉溶液對落葉松八齒小蠹進(jìn)行體表消毒30 s，用無菌的鑷子將蟲體置于2%水瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行蟲體表面真菌分離。

采用菌絲先端純化法對組織分離培養(yǎng)的真菌進(jìn)行純化，純化后得到的真菌接于2%MEA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)。

1.3 菌株形態(tài)學(xué)

將分離純化得到的菌株在2%MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，每天記錄菌絲形態(tài)，生長情況，待其長出子實(shí)體釋放出孢子后，在顯微鏡下觀察菌株的子囊殼、子囊、子囊孢子、分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)特征，并進(jìn)行描述、測量和拍攝。每一形態(tài)特征測量50組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.4 菌株生長速率測定

用直徑為5 mm的無菌打孔器從在2%MEA培養(yǎng)基上旺盛生長的實(shí)驗(yàn)菌株邊緣切下菌餅，置于相同培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)皿中央。菌餅生長菌絲的一面與培養(yǎng)基直接接觸，每個菌株做3個重復(fù)，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5 DNA提取

對純化所得菌株采用2%液體PDA培養(yǎng)基置于25 ℃搖床下黑暗培養(yǎng)7 d，挑取適量菌絲于濾紙上，用無菌水沖洗菌絲至濾液澄清，菌絲烘干，備用。DNA提取采用CTAB法用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

1.6 PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)采用25 μL的PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，濃度1 μmol/L的引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix(0.1 U Taq Polymerase/μL, 500 μmol/L dNTP each, 20 mmol/L Tris-HCL(pH8.3), 100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2)12.5 μL, 9.5 μL ddH2O。不同DNA基因片段的擴(kuò)增條件及所需引物如表1所示[27]。PCR產(chǎn)物采用2.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一、清晰的送往北京寶銳通生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 基因擴(kuò)增所需引物、引物序列及擴(kuò)增程序統(tǒng)計(jì)表Table 1 The information about the Primers and the PCR conditions

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

上述獲得的基因序列首先在基因庫(GenBank)內(nèi)利用BLAST進(jìn)行搜索比對，獲得與已知序列初步的相關(guān)性，下載相關(guān)已發(fā)表序列，連同本實(shí)驗(yàn)獲得的19株菌株的核苷酸序列利用ClustalX 2.0進(jìn)行序列比對(Alignment)。經(jīng)過比對完成的序列利用最大簡約法(PAUP×version 4.0b10)以及貝葉斯方法(MrBayers3.1.2)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建時(shí)采用MCMC算法，運(yùn)行5000000代，模型的選擇采用MrModeltest2.3軟件進(jìn)行檢測。采用PAUP軟件對ITS，β-tubulin以及MAT- 2 HMG box三段基因進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)，判斷三段基因是否可以用來構(gòu)建基因聯(lián)合樹。選取Ceratocystispolonica作為外群[23]。實(shí)驗(yàn)所采用菌株及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所需參考菌株信息如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)用Ceratocystis屬菌株及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹參考菌株信息表

Table 2 Fungal isolates obtained from different hostsIpssubelongatusinfested and isolates of known species included for reference purposes

物種Speciesidentit菌株編號寄主Host植物/昆蟲Plant/Insect采集Origin地采集者Collector分離日期Dateofisolation登錄號GenbankNo.*ITSβ-tubulinMAT-2HMGbox富士長喙殼CeratocystisCXY1505興安落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹Larixgmelini/Ipssubelongatus內(nèi)蒙古根河本文2011KC762579KF773013KJ634488fujiensisCXY1506興安落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹Larixgmelini/Ipssubelongatus內(nèi)蒙古根河本文2011KC762578--CXY1507興安落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹Larixgmelini/Ipssubelongatus內(nèi)蒙古根河本文2011KC762577KF773015KJ634489CXY1508興安落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹Larixgmelini/Ipssubelongatus內(nèi)蒙古根河本文2011KC762576KF773014KJ634490CXY1509興安落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹Larixgmelini/Ipssubelongatus內(nèi)蒙古根河本文2011KC762575--CXY1515華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762574KF773017KJ634494CXY1516華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762573KF773018KJ634495CXY1517華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762572KF773019KJ634496CXY1518華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762571--CXY1514華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762570-KJ634493CXY1511華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762569--CXY1512華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762568KF773020KJ634491CXY1513華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762567-KJ634492CXY1510華北落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.principis-rupprechtii/I.subelon-gatus內(nèi)蒙古黃崗梁本文2011KC762566KF773016-CXY1522長白落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.olgensis/I.subelongatus黑龍江古城本文2012KC762584--CXY1519長白落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.olgensis/I.subelongatus黑龍江古城本文2012KC762583KF773023KJ634497CXY1520長白落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.olgensis/I.subelongatus黑龍江古城本文2012KC762582--CXY1521長白落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.olgensis/I.subelongatus黑龍江古城本文2012KC762581KF773022KJ634498CXY1523長白落葉松/亞洲落葉松八齒小蠹L.olgensis/I.subelongatus黑龍江古城本文2012KC762580KF773021KJ634499C.polonicaCMW5026歐洲云杉/云杉八齒小蠹Piceaabies/Ipstypographus澳大利亞,T.Kirisits1997AY233907AY233932AY233959CMW8845樟子松/橫坑切梢小蠹Pinussylves-tris/Tomicusminor澳大利亞T.Kirisits1998AY233890AY233926AY233956CMW2284日本魚鱗松/亞洲落葉松八齒小蠹變種P.jezoensis/I.typographusjaponi-cus日本,北海道Y.Yamaoka1989AY233894AY233935AY233964CMW2210日本魚鱗松/亞洲落葉松八齒小蠹變種P.jezoensis/I.typographusja-ponicus日本,北海道Y.Yamaoka1990AY233897AY233936AY233960CMW8830歐洲云杉/云杉八齒小蠹Piceaabies/Ipstypographus挪威T.KirisitsH.Solheim1992AY233889AY233929AY233955CMW8873歐洲云杉/云杉八齒小蠹Piceaabies/I.typographus挪威T.KirisitsH.Solheim1990AY233888AY233928AY233954CMW2272日本魚鱗松/亞洲落葉松八齒小蠹變種P.jezoensis/I.typographusja-ponicus日本,北海道Y.Yamaoka1990AY233893AY233934-CMW7151歐洲云杉/云杉八齒小蠹Piceaabies/I.typographus澳大利亞R.GrubelnikT.Kirisits1997AY233896--

續(xù)表

續(xù)表

內(nèi)蒙古根河實(shí)驗(yàn)林場，經(jīng)緯度：121°37′12″E，50°50′15″N；內(nèi)蒙古克什克騰旗黃崗梁實(shí)驗(yàn)林場，經(jīng)緯度：117°31′14″E 43°35′08″N；黑龍江古城鎮(zhèn)湖水林場，經(jīng)緯度：130°13′06″E 45°23′34″N；-：該序列信息無

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌分離和形態(tài)學(xué)鑒定

實(shí)驗(yàn)從103份標(biāo)本上共分離得到長喙殼類真菌157株，其中包括Ceratocystis屬真菌19株，這些菌株在生長速率、培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)特征上表現(xiàn)出一致性，可知19株真菌為同一個種。19株Ceratocystis屬真菌菌株分別在內(nèi)蒙古根河、黃崗梁和黑龍江古城3個地區(qū)分離得到，分離率分別為40%、31%和22%。

通過對上述菌株進(jìn)行生理學(xué)以及形態(tài)學(xué)觀察分析結(jié)果顯示，在25 ℃黑暗恒溫，2%MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，菌株在第4天到第5天生長速率最快，達(dá)到21 mm/d，在第7天時(shí)可長滿直徑為85 mm的一次性塑料培養(yǎng)基。在2%MEA培養(yǎng)基上新生菌絲灰白色，中央橄欖綠色，菌絲生長較快，菌落中央呈絨氈狀，致密，較厚(圖1-a，圖1-b)。

試驗(yàn)分離純化得到的菌株在形態(tài)上基本一致，選用菌株CXY1506和CXY1517進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察。子囊殼褐色至黑色，基部球形，表生，子囊殼直徑132—274 μm(圖1-c，圖1-d)，著生大量褐色菌絲。菌絲長度250—626 μm(圖1-g，圖1-h)。頸暗褐色至黑色，直立或稍彎曲，長360—1201 μm，壁光滑，圓錐狀，由頸基部向頸頂部逐漸變細(xì)，頸基部寬32—58 μm，頂部寬10—24 μm(圖1-c，圖1-d)。孔口緣絲透明，向外稍傾斜，孔口緣絲長25—57 μm(圖1-e，圖1-f)。子囊原囊壁漸消解，子囊孢子長3.5—6.1 μm，寬1.2—2.4 μm(圖1-i)，橢圓形，有膠質(zhì)鞘，單細(xì)胞透明。分生孢子圓柱形，單細(xì)胞透明，長7.6—22.7 μm，寬3.5—7.8 μm(圖1-j)。顯微形態(tài)觀察特征顯示與Ceratocystisfujiensis[23]無明顯區(qū)別。

圖1 Ceratocystis fujiensis 形態(tài)學(xué)特征圖(CXY1506，CXY1517)Fig 1 Light micrographs of Ceratocystis fujiensis(CXY1506，CXY1517)a.菌株CXY1517在MEA培養(yǎng)基上25 ℃條件下培養(yǎng)5 d的菌落形態(tài)；b.菌株CXY1506在MEA培養(yǎng)基上25 ℃條件下培養(yǎng)5 d的菌落形態(tài)；c,d.子囊殼(100 μm)；e,f.孔口緣絲(20 μm)；g,h.營養(yǎng)菌絲(20 μm)；I.子囊孢子(10 μm); j.分生孢子(10 μm)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

用ClustalX 2.0對44個ITS序列進(jìn)行比對，利用PAUP* version 4.0b10最大簡約法分析結(jié)果顯示，比對的547個特征視為無序且權(quán)重相同，其中恒量特征492個，29個有簡約信息的變量特征。利用最大簡約法構(gòu)建的聯(lián)合樹步長(Tree length)為71，一致性指數(shù)(Consistency index, CI)為0.7587，保留指數(shù)(Retention index, RI)為0.9548，趨同性指數(shù)(Homoplasy index, HI)為0.2143，可調(diào)一致性指數(shù)(Rescaled consistency index, RC)為0.8337。MP樹表明43個內(nèi)群分為3個主要分支，分別為Ceratocystispolonica,C.fujiensis,C.laricicola(圖2)。本實(shí)驗(yàn)分離所得菌株與日本C.fujiensis3個菌株以及周秀華等[28]分離得到的C.fujiensis菌株聚集為1個分支，其中周秀華所分離的菌株構(gòu)成1個亞分支，與其他C.fujiensis均有4個變化；CXY1510和CXY1512構(gòu)成一個亞分支，與其他C.fujiensis均有3個變化；日本菌株CMW1952和CMW1969與中國菌株CXY1517，CXY1516，CXY1523均有1個變化；而CXY1518具有兩個變化?；贗TS基因的MP樹3個分支的節(jié)點(diǎn)支持率(BS)均高于或等于80%(圖2)。采用貝葉斯方法進(jìn)行貝葉斯樹的構(gòu)建，采用MCMC算法，共運(yùn)行5000000代，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與MP樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致，貝葉斯分析結(jié)果顯示后驗(yàn)概率(PP)均高于或等于0.80。圖2中最后顯示節(jié)點(diǎn)支持率為BS/PP。

圖2 基于ITS序列采用PAUP軟件構(gòu)建的最大簡約樹(MP樹)Fig.2 Phylogram obtained from DNA sequence data of the ITS region with the maximum parsimony method

圖3 基于ITS，β-tubulin以及MAT- 2 HMG box三段基因構(gòu)建的MP聯(lián)合樹Fig.3 Phylogram obtained from MP analyses of the ITS, β-tubulin and MAT- 2 HMG box sequence data

對要進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的3個位點(diǎn)的DNA序列進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)(Pvalue=0.451)，發(fā)現(xiàn)3個位點(diǎn)的DNA序列可以進(jìn)行基因聯(lián)合樹的構(gòu)建。利用ClustalX 2.0對ITS、β-tubulin以及MAT- 2 HMG box三段基因進(jìn)行DNA序列比對。最大簡約法分析比對的1269個特征視為無序且權(quán)重相同，結(jié)果顯示，其中恒量特征為1204個，32個無簡約信息的變量特征以及33個有簡約信息的變量特征。利用最大簡約法構(gòu)建的聯(lián)合樹步長(Tree length)為72，一致性指數(shù)(CI)為0.8974，保留指數(shù)(RI)為0.9778，趨同性指數(shù)(HI)為0.1026，可調(diào)一致性指數(shù)(RC)為0.9325，得到各節(jié)點(diǎn)支持率為BS。MP樹表明23個內(nèi)群分為3個主要分支，分別對應(yīng)種C.polonica，C.fujiensis，C.laricicola(圖3)。本實(shí)驗(yàn)分離所得菌株與日本3個菌株聚為1支，最后節(jié)點(diǎn)支持率BS/PP=94/0.98。其中本實(shí)驗(yàn)分離到的菌株與日本菌株CMW1965聚集為1個亞分支，后驗(yàn)概率PP=1.00，節(jié)點(diǎn)支持率BS=96；其中菌株CXY1512，CXY1505，CXY1507構(gòu)成1個亞分支，CXY1516和CXY1517構(gòu)成1個亞分支，與其他C.fujiensis均有1個變化。CXY1508，CXY1515，CXY1523，CMW1519，CMW1521具有一致性，而日本菌株CMW1969和CMW1952構(gòu)成1個單獨(dú)的分支。該MP聯(lián)合樹3個分支的節(jié)點(diǎn)支持率(BS)均高于或等于94%(圖3)。利用MrModeltese2.3進(jìn)行模型檢測，在AIC(Akaike Information Criterion)標(biāo)準(zhǔn)下，獲得最佳模型HKY+I。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法采用MCMC算法，共運(yùn)行5000000代，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與MP樹完全一致，結(jié)果顯示后驗(yàn)概率(PP)均高于或等于0.83，多數(shù)節(jié)點(diǎn)后驗(yàn)概率值為1.00。

3 結(jié)論與討論

本研究對我國東北異域分布的3種落葉松林內(nèi)的落葉松八齒小蠹危害的寄主坑道組織和蟲體標(biāo)本進(jìn)行采集和系統(tǒng)分離長喙殼真菌，獲得的Ceratocystis屬菌株進(jìn)行生理學(xué)特性、菌落特征、微觀形態(tài)學(xué)的觀察，以及基于ITS、β-tubulin、MAT- 2 HMG box多位點(diǎn)DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)分離得到Ceratocystisfujiensis菌株19株。該種首先在日本發(fā)現(xiàn)[23]，已與亞洲落葉松八齒小蠹形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，是伴生菌區(qū)系中的先鋒種和致病力最強(qiáng)的病原菌，人工接種條件下可以致死30年生的日本落葉松(Larixkaempferi)[21- 22]。我國學(xué)者曾在長白落葉松和興安落葉松的小蠹蟲坑道分離到3株該病原菌[28]。本研究首次從大興安嶺的興安落葉松，長白山地區(qū)的長白落葉松和大興安嶺余脈不同地域分布的華北落葉松林內(nèi)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)C.fujiensis，表明該病原性真菌在我國東北、華北落葉松林內(nèi)廣泛分布，與落葉松八齒小蠹形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系。

在歐洲分布的云杉八齒小蠹伴生菌C.polonica和落葉松八齒小蠹伴生菌C.laricicola具有明顯的寄主分化特征，接種試驗(yàn)證明只能在各自的寄主(歐洲云杉Piceaabies和歐洲落葉松Larixdecidua)上造成顯著的病斑，而無法成功侵染另一寄主，即形成了“Piceaabies-Ipstypographus-C.polonica”和“Larixdeciduas-Ipscembrae-C.laricicola”的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系[30]。日本也發(fā)現(xiàn)落葉松八齒小蠹伴生菌的分化特征，即“Larixkaempferi-Ipssubelongatus-C.fujiensis”的協(xié)同進(jìn)化[23]。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示C.fujiensis在我國也與危害3種本土落葉松寄主的落葉松八齒小蠹形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，支持了這種協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，即特定種的小蠹蟲與特定種的真菌穩(wěn)定伴生形成了種特異性伴生的進(jìn)化趨勢。尚需進(jìn)一步研究C.fujiensis和C.laricicola在不同落葉松寄主(歐洲落葉松和亞洲落葉松)上的交叉接種，以及C.fujiensis和C.polonica在云杉(歐洲云杉、日本云杉等)和亞洲落葉松(包括日本落葉松、興安落葉松、長白落葉松和華北落葉松等)上的交叉接種試驗(yàn)，以驗(yàn)證這種協(xié)同進(jìn)化形成的伴生菌的寄主分化特征。

伴生菌適應(yīng)寄主植物和小蠹蟲的分化潛力已在不同地理(或寄主)種群中發(fā)現(xiàn)。日本的云杉八齒小蠹(I.typographusf.japonicus)被視為歐洲種的1個變種，兩個種群間存在明顯的遺傳隔離[31- 32]，危害不同的云杉寄主；盡管二者均與C.polonica形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，但該伴生菌在兩個地區(qū)存在顯著的遺傳差異，分化為明顯的兩個地理(或寄主)種群[33],即“Piceaabies-Ipstypographus-C.polonica歐洲種群”和“Piceajezoensis(日本云杉)-I.typographusf.japonicus-C.polonica日本種群”。

盡管我國落葉松八齒小蠹與日本落葉松八齒小蠹屬為同一種，但其線粒體基因序列顯示二者存在不同單倍體型的差異[18]，而且我國落葉松八齒小蠹的長白落葉松種群和興安落葉松種群間存在信息素響應(yīng)的二型現(xiàn)象，可能二者為不同的地理(或寄主)種群[26]。亞洲落葉松八齒小蠹存在著豐富的種下分化現(xiàn)象。由基于ITS序列的MP樹(圖2)可見，C.fujiensis表現(xiàn)出豐富的種內(nèi)分化。同時(shí)基于多DNA序列的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)可見，相比較地域分布更為廣泛的C.polonica和C.laricicola，C.fujiensis卻表現(xiàn)出更加豐富的種內(nèi)分化，聚類出兩個亞分支，一支為日本的兩個菌株，另一分支為日本的1個菌株和中國的所有菌株聚在一起；盡管中國菌株并未表現(xiàn)出3種寄主的分化特征，但危害長白落葉松的落葉松八齒小蠹的伴生菌種群表現(xiàn)出更加一致的DNA序列(圖3)。這種伴生菌豐富的種下分化顯示出與其寄主和媒介昆蟲豐富的遺傳多樣性的平行結(jié)構(gòu)，值得從更大的樣本量和更全面的分析，例如調(diào)查全基因組的遺傳多樣性，揭示C.fujiensis和小蠹蟲種群下是否有隱存種或種群分化的存在，以驗(yàn)證是否也存在著特異性伴生的進(jìn)化現(xiàn)象。

[1] 楊靜莉, 林強(qiáng), 陳國發(fā). 落葉松八齒小蠹的危險(xiǎn)性分析. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007, 35(3):60- 63.

[2] 胡新生, Ennos R A, 王笑山. 論我國興安落葉松、長白落葉松及華北落葉松種間遺傳進(jìn)化關(guān)系. 林業(yè)科學(xué),1999, 35(3): 84- 96.

[3] 蕭剛?cè)? 中國森林昆蟲. 北京：中國林業(yè)出版社, 1992.

[4] 殷惠芬, 黃復(fù)生. 中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志. 北京: 科學(xué)出版社, 1984, 54- 55.

[5] 國家林業(yè)局2013年第4號公告http://www.forestry.gov.cn/portal/main/govfile/13/govfile_1983.htm [2013- 3- 15]

[6] Kirisits T. Fungal associates of European bark beetles with special emphasis on the ophiostomatoid fungi// Lieutier F, Day K R, Battisti A, Grégoire J C, Evans H F, eds. Bark and Wood Boring Insects in Living Trees in Europe. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2004: 181- 236.

[7] Wingfield M J, Seifert K A, Webber J F.CeratocystisandOphiostoma: Taxonomy, Ecology and Pathogenicity. Minnesota, USA: American Phytopathological Society, 1993.

[8] 呂全.中國紅脂大小蠹伴生菌的系統(tǒng)發(fā)育及其生物生態(tài)學(xué)習(xí)性[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2007.

[9] Hartig T. Ambrosia des Bostrichus dispar. Allgemeine Forst-Und Jagdzeitung, 1844, 13: 73- 73.

[10] Cognato A I, Sun J H. DNA based cladograms augment the discovery of a newIpsspecies from China (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Cladistics, 2007, 23(6): 539- 551.

[11] Grégoire J C, Evans H. Damage and control of BAWBILT organisms an overview// Lieutier F, Day K R, Battisti A, Grégoire J C, Evans H F, eds. Bark and Wood Boring Insects in Living Trees in Europe. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2004: 19- 37.

[12] Christiansen E.Ceratocystspolonicainoculated in Norway spruce: Blue-staining in relation to inoculum density, resinosis and tree growth. European Journal of Forest Pathology, 1985, 15(3): 160- 167.

[13] Kirisits T. Fungi isolated fromPiceaabiesinfested by the bark beetleIpstypographusin the Biaowiea forest in north-eastern Poland. Forest Pathology, 2010, 40(2): 100- 110.

[14] Aghayeva D N, Wingfield M J, deBeer Z W, Kirisits T. Two newOphiostomaspecies withSporothrixanamorphs from Austria and Azerbaijan. Mycologia, 2004, 96(4): 866- 878.

[15] Jankowiak R, Rossa R, Mista K. Survey of fungal species vectored byIpscembraeto European larch trees in Raciborskie forests (Poland). Czech Mycology, 2007, 59(2): 227- 239.

[16] Redfern D B. The roles of the bark beetle Ips cembrae, the woodwasp Urocerus gigas and associated fungi in dieback and death of larches// Wilding N, Collins N M, Hammond P M, Webber J F, eds. Insect-Fungus Interactions. 14th Symposium of the Royal Entomological Society of London in collaboration with the British Mycological Society. London: Academic Press, 1989: 195- 204.

[17] Redfern D B, Stoakley J T, Steele H, Minter D W. Dieback and death of larch caused byCeratocystislaricicolasp. nov. following attack byIpscembrae. Plant Pathology, 1987, 36(4):467- 480.

[18] Stauffer C, Kirisits T, Nussbaumer C, Pavlin R, Wingfield M J. Phylogenetic relationships between the European and Asian eight spined larch bark beetle populations (Coleoptera, Scolytidae) inferred from DNA sequences and fungal associates. European Journal of Entomology 2001, 98(1): 99- 105.

[19] Aoshima K. Studies on Wood-staining Fungi of Japan(in Japanese with English Sunnary) [D]. Tokyo: University of Tokyo, 1965.

[20] Chung W H, Kim J J, Yamaoka Y. Uzunovic A, Masuya H, Breuil C.Ophiostomabreviusculumsp. nov.(Ophiostomatales, Ascomycota) is a new species in theOphiostomapiceaecomplex associated with bark beetles infesting larch in Japan. Mycologia, 2006, 98(5): 801- 814.

[21] Yamaoka Y C, Hizai M, Chung W H, Masuya H. Constant association of ophiostomatoid fungi with the bark beetleIpssubelongatusinvading Japanese larch logs. Mycoscience, 2009, 50(3):165- 172.

[22] Yamaoka Y, Wingfield M J, Ohsawa M, Kuroda Y. Ophiostomatoid fungi associated withIpscembraein Japan and their pathogenicity of Japanese larch. Mycoscience, 1998, 39(4):367- 378.

[23] Marin M, Preisig O, Wingfield B D, Kirisits T, Yamaoka Y, Wingfield M J. Phenotypic and DNA sequence data comparisons reveal three discrete species in theCeratocystispolonicaspecies complex. Mycological Research, 2005, 109(10): 1137- 1148.

[24] Francke-Grosmann H. Ectosymbiosis in wood-inhabiting insects// Henry S M, ed. Symbiosis. New York: Academic Press, 1967, 2: 141- 205.

[25] Paine T D, Raffa K F, Harrington T C. Interactions amongScolytidbark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annual Review of Entomology, 1997, 42(1): 179- 206.

[26] Song L W, Zhang Q H, Chen Y Q, Zuo T T, Ren B Z. Field responses of the Asian larch bark beetle,Ipssubelongatus, to potential aggregation pheromone components: disparity between two populations in northeastern China. Insect Science, 2011, 18(3): 311- 319.

[27] Paciura D, Zhou X D, DeBeer Z W, Jacobs K, Ye H, Wingfield M J. Characterisation of synnematous bark beetle-associated fungi from China, includingGraphiumcarbonariumsp nov. Fungal Diversity, 2010, 40(1): 75- 88.

[28] 周秀華, 宋瑞清, 曹翠, 崔磊, 梁曉東, 潘建中, 朱元金, 胡振宇. 落葉松八齒小蠹伴生真菌 3 個菌株的鑒定及生物學(xué)生理學(xué)特性. 林業(yè)科學(xué),2011, 47(5):82- 86.

[29] 周秀華, 宋瑞清, 周旭東, 崔磊, 曹翠. 落葉松八齒小蠹體內(nèi)外和坑道內(nèi)真菌類群. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(3): 400- 407.

[30] Harrington T C, Pashenova N V, McNew D L, Steimel J, Konstantinov M Y. Species delimitation and host specialization ofCeratocystislaricicolaandC.polonicato larch and spruce. Plant Disease, 2002, 86(4): 418- 422.

[31] Sallé A, Arthofer W, Lieutier F, Stauffer C, Kerdelhué C. Phylogeography of a host-specific insect: genetic structure ofIpstypographusin Europe does not reflect past fragmentation of its host. Biological Journal of the Linnean Society, 2007, 90(2): 239- 246.

[32] Stauffer C, Lakatos F.Ipstypographusf.japonicusNiijima (Col., Scolytidae): a genetic analysis by allozymes and mitochondrial sequence data// Jandl R, Devall M, Khorchidi M, Schimpf E, Wolfrum G, Krishnapillay KB, eds. Pramaju Sdn. Bhd, Vol. 3, Poster Abstracts, Forests and Society: The Role of Research. XXI IUFRO World Congress. Kuala Lumpur, 2000: 397- 397.

[33] Marin M, Preisig O, Wingfield B D, Kirisits T, Wingfield M J. Single sequence repeat markers reflect diversity and geographic barriers in Eurasian populations of the conifer pathogenCeratocystispolonica. Forest Pathology, 2009, 39(4): 249- 265.

The species specific associations betweenIpssubelongatusand ophiostomatoid fungi

MENG Xianjing1, Lü Quan1，*, LIU Xuewei1, JIAO Xiangjie2, LIANG Jun1, ZHANG Xingyao1

1KeyLaboratoryofForestryProtection,StateForestryAdministration;ResearchInstituteofForestEcology,EnvironmentandProtection,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China2GuangxingForestryFarm,KeShiKeTengqi,ChifengCityinInnerMongolia,Chifeng025350,China

The bark-beetles and ophiostomatoid fungi formed a stable association relationship in nature. It is a universal ecology phenomenon occurring frequently in forest ecological systems. The association between the beetles and fungi are regarded to some extent as a symbiosis in a broad sense. They have been extensively and intensively documented and illustrated from all over the world since it was first realized. Some research showed thatIpsbeetles spread over Eurasia were extensively associated with a number of ophiostomatoid fungi species. Among which, some species are important pathogens of conifers. Although the morphology and ecology characteristics of threeIpsbeetles,I.typographus,I.cembrae, andI.subelongatuswere almost identical, these beetles were evidenced in a series studies as distinct species based on the phylogenetic analysis of DNA information and critical morphological comparison. In parallel, an ophiostomatoid fungus,Ceratocystispolonicapreviously recognized as a closely associated fungus with these beetles was also separated into three distinct entities resided in theCeratocystiscoerulescensspecies complex, and stably associated with three kinds of bark beetles, respectively, where a species specific association between bark beetles and ophiostomatoid fungi was established. The species specific association was understood as a result of co-evolution in forests where both partners lived together in a common habitat. The samples collected in this study from three allopatricLarixhosts whichIpssubelongatusattacked seriously. The ophiostomatoid strains were isolated from the body surface ofIpssubelongatus, blue-stain tissue or the galleries bark-beetles attacked. Observations of the colony, physiology and morphology characteristic, and comparisons of anamorph and teleomorph structures of allCeratocystisstrains, confirmed that the strains are indistinguishable fromCeratocystisfujiensisM.J.Wingf. The phylogenetic analysis based on sequences derived from the ITS regions of the rDNA operon, the partial β-tubulin gene and the MAT- 2 HMG box gene, further determined a total of nineteen fungal strains as speciesCeratocystisfujiensis. The study first determinedCeratocystisfujiensisextensively existed in three allopatric larch forests in northeast and north China, which formed a stable association relationship withIpssubelongatusunder such ecological conditions.Ceratocystisfujiensiswas proved as a dominant fungus associated withIpssubelongatusin Japan, and a pioneer species and the strongest pathogenic fungus in all the bark-beetles associated fungi. BecauseC.fujiensiswidely infestingLarixspp. plants in China, inevitably, this phenomenon should be paid high attention. The study provides scientific basis to make the policies and measures for the government to prevent and control the composite damages of diseases and pests effectively. The result in this paper provides support to the hypothesis of species specific association betweenIpsbeetles and ophiostomatoid fungi. Meanwhile, the multi-gene sequences characteristic indicates thatI.subelongatusandC.fujiensisexist significant genetic diversity in different geographic populations, which probably predict the possibility of the species specific association occurred under species levels. The associations betweenIpsbeetles and ophiostomatoid fungi exhibit an ideal insight into completely understanding the symbiotic relationship between the bark beetles and ophiostomatoid fungi, and species specific association as well.

Ipssubelongatus;Ceratocystisfujiensis; phylogeny;Larixspp.; pathogen

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFRIFEEP201102); 國家自然科學(xué)基金(31070571)

2013- 04- 01;

日期:2014- 07- 03

10.5846/stxb201304010576

*通訊作者Corresponding author.E-mail: luquan@caf.ac.cn

孟賢靜，呂全，劉學(xué)偉，焦相杰，梁軍，張星耀.落葉松八齒小蠹與長喙殼真菌間的種特異性伴生關(guān)系.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(2):313- 323.

Meng X J, Lü Q, Liu X W, Jiao X J, Liang J, Zhang X Y.The species specific associations betweenIpssubelongatusand ophiostomatoid fungi.Acta Ecologica Sinica,2015,35(2):313- 323.