尹鵬先 蔡靖 李厚華 Melvin T T 姜在民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

東亞唐棣組織培養(yǎng)體系1)

尹鵬先 蔡靖 李厚華 Melvin T T 姜在民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

以東亞唐棣帶芽莖段為外植體，研究了不同消毒方法對于無菌體系建立的影響、不同類型的芽對于誘導(dǎo)萌發(fā)的影響、不同基本培養(yǎng)基以及激素組合對于增殖與生根的影響。結(jié)果表明：較為適合東亞唐棣消毒的方法為75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl2消毒8 min，萌發(fā)率為16.7%；帶有一側(cè)芽的頂芽為較為合適的外植體，萌發(fā)率可達(dá)87.6%；最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá)4.8；最適生根培養(yǎng)基為1/4MS+NAA 0.1 mg·L-1。

東亞唐棣；組織培養(yǎng)；擴繁；生根培養(yǎng)

We used the explants from buds to study the influence of different disinfection methods, basal media, phytohormone on shoot proliferation, rooting ofAmelanchierasiatica. The best disinfection method was 75% Ethanol for 30 s and 0.1% HgCl2for 8 min. The explant suitable for bud initiation was top bud with an axillary bud with the initiation rate of 87.6%. Optimal shoot proliferation occurred on MS medium with 3.0 mg·L-1BA and 0.1 mg·L-1NAA. The best rooting was 1/4 MS with 0.1 mg·L-1NAA.

東亞唐棣(Amelanchierasiatica)屬于薔薇科蘋果亞科唐棣屬，是我國僅產(chǎn)的兩種唐棣屬植物之一，分布于我國浙江、江西、安徽等地。落葉喬木或灌木，花期4—5月份，花為總狀花序，具多數(shù)花朵，花白色，花瓣卵狀披針形；果期8—9月份，果實球形或扁球形，直徑6～8 mm，紫黑色[1]。東亞唐棣樹形優(yōu)美，花朵繁密，果實含鈣量高，兼具較高的觀賞價值與食用價值,是不可多得的園林綠化樹種。我國園林植物資源極為豐富，但包括東亞唐棣在內(nèi)的大量可供觀賞的種類仍然處于野生狀態(tài)，未被開發(fā)利用[2-3]。隨著我國對于園林綠化樹種種類以及質(zhì)量的需求與日俱增，東亞唐棣的發(fā)展前景十分廣闊。

唐棣屬植物在中國僅有兩個種，為唐棣(Amelanchiersinica)及東亞唐棣[1，4]，有關(guān)其組織培養(yǎng)體系的研究在國內(nèi)外均未見到相關(guān)報道。Magdalena et al.[5]研究了不同貯藏方式對加拿大唐棣(Amelanchiercanadensis)果實抗氧化活性的影響，Pruski et al.[6]、Baldwin et al.[7]以及杜保國[8]、林寶山[9]對榿葉唐棣(Amelanchieralnifolia)組織培養(yǎng)有過一定的研究。文中以東亞唐棣帶芽莖段為外植體，對其組織培養(yǎng)體系的建立進(jìn)行了研究，以期為東亞唐棣園林綠化的規(guī)模化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

試驗材料為2012年7月中旬采自西北農(nóng)林科技大學(xué)校園的當(dāng)年生帶芽莖段。

外植體消毒：將采集的枝條用小毛刷刷洗干凈，剪成3～5 cm帶芽莖段，帶芽莖段為隨機混合的頂芽、側(cè)芽及帶頂芽的側(cè)芽。去除莖段葉片留下葉柄基部3～4 mm，于自來水下沖洗1～2 h。在超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗2次，再分別用0.1% HgCl2消毒4、6、8、10、12 min，無菌水沖洗3次，消毒過程中輕微搖晃，10 d后統(tǒng)計污染率。

芽的誘導(dǎo)萌發(fā)與增殖培養(yǎng)：分別取頂芽、側(cè)芽、帶頂芽的側(cè)芽消毒后接種于MS+3.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上，每種組合接種40～60瓶，每瓶1個，重復(fù)3次。15 d后統(tǒng)計不同類型芽的萌發(fā)率，萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)/未污染個數(shù)。

在芽的萌發(fā)過程中，每隔一周不斷切去莖段基部褐化的部位，待芽長至2～3 cm時，將芽轉(zhuǎn)至同一培養(yǎng)基中待其增殖，以獲得更多數(shù)量的組培苗用于后續(xù)試驗。

選取生長狀況相似的組培苗開展增殖培養(yǎng)試驗，采用2因素3水平完全隨機設(shè)計，探討6-BA、NAA兩種不同激素水平對增殖的影響。試驗以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA選擇1.0、2.0、3.0 mg·L-13個水平，NAA選用0.05、0.10、0.20 mg·L-13個水平，共設(shè)置9種組合，每種組合接種10瓶，每瓶3個組培苗，共重復(fù)3次。50 d后統(tǒng)計增殖與生長狀況。增殖系數(shù)=增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)。生長狀況劃分為3個健康指數(shù)：“1”、“2”、“3”，其中“1”表示組培苗生長健壯，莖干粗壯，葉片大而鮮綠，無黃葉及玻璃花苗；“2”表示生長較為健壯，黃葉較少，無玻璃化苗；“3”表示生長一般，葉片小而卷曲，存在部分黃葉，莖干細(xì)弱。

生根培養(yǎng)：以生長健壯的2 cm以上的增殖苗為材料，采用2因素3水平完全隨機設(shè)計，研究基本培養(yǎng)基與激素水平對生根的影響?；九囵B(yǎng)基選擇MS、1/2MS、1/4MS、1/6MS、1/8MS；激素選擇NAA，分為0.1、0.5、1.0 mg·L-13個水平。每個處理接種10瓶，每瓶3個，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計生根率及生長情況。

以上培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強度2 000 lx，光照時間每天12 h。培養(yǎng)基均附加蔗糖30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對無菌體系建立的影響

消毒方法對于外植體的影響較大，正確選擇消毒方法對于無菌體系的建立起著關(guān)鍵的作用。由表1可知，高污染率和低萌發(fā)率是東亞唐棣無菌體系建立的重要限制因子，隨著0.1% HgCl2處理外植體時間的加長，污染率隨之降低，同時褐化死亡率升高。HgCl2處理時間較長，對植物組織的傷害較大，褐化死亡率較高；處理時間較短，污染率較高。綜合考慮，選擇75%酒精消毒30 s、0.1% HgCl2消毒8 min為較為適宜的消毒方法。

表1 不同消毒方法對無菌體系建立的影響

2.2 不同類型的芽對于誘導(dǎo)萌發(fā)的影響

接種10 d后部分芽開始膨大，芽鱗展開，15 d后有新葉展開。不同類型的外植體對于芽的萌發(fā)影響較大(表2)(圖1A-C)。頂芽雖然最為飽滿，但未發(fā)現(xiàn)有萌發(fā)現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時間的增長，頂芽逐漸褐化死亡。側(cè)芽萌發(fā)率較低，僅為21.4%，且誘導(dǎo)出的新芽質(zhì)量相對較弱。帶有一個頂芽的側(cè)芽，在培養(yǎng)一段時間后，頂芽不萌發(fā)，緊鄰頂芽的側(cè)芽開始萌發(fā)(圖1D-E)，且萌發(fā)率較高，可達(dá)87.5%(表2)。

表2 不同類型的芽對于誘導(dǎo)萌發(fā)的影響

A-C.不同類型的芽，分別為頂芽(A)、側(cè)芽(B)、帶有一個側(cè)芽的頂芽(C)；D-E.側(cè)芽開始有新葉展開；F.組培苗的增殖；G-H.生根培養(yǎng)。

2.3 不同激素組合對于東亞唐棣組培苗增殖的影響

將組培苗接入增殖培養(yǎng)基后約15 d，組培苗基部切口處開始分化出小的芽點。培養(yǎng)50 d后的統(tǒng)計結(jié)果表明，增殖苗的數(shù)量隨著6-BA的增高而增加，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，增殖苗數(shù)量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(表3)。不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA的配比取得效果差異較大，在6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.20 mg·L-1的培養(yǎng)基上能取得較多的愈傷組織，在6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.20 mg·L-1培養(yǎng)基上生長的苗增殖情況較差，但最為健壯，且有部分生根。綜合考慮，較為適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá)4.87(圖1F)。

2.4 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基及激素組合對于東亞唐棣組培苗生根的影響

生根培養(yǎng)10 d左右，有小根從切口處產(chǎn)生，培養(yǎng)30 d后在1/4MS+0.1 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上生根率最高，可達(dá)93.0%(圖1G-H)，生根數(shù)最高，可達(dá)3.68條，根長最長，可達(dá)3.55 cm；在MS+0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上健康指數(shù)最高，可達(dá)2.62(表4)。生根率隨著無機鹽質(zhì)量濃度的降低呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

表3 不同激素組合對于東亞唐棣組培苗增殖的影響

注：表中健康指數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

表4 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基及激素組合對于東亞唐棣組培苗生根的影響

試驗號植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度/mg·L-1基本培養(yǎng)基NAA生根率/%平均生根數(shù)/條根長/cm健康指數(shù)1MS0.128.90.551.222.43±0.702MS0.53.20.031.672.62±0.533MS1.06.20.181.562.44±0.7241/2MS0.151.71.142.332.00±0.6751/2MS0.535.31.623.152.07±0.6861/2MS1.04.80.742.672.07±0.7071/4MS0.193.03.683.552.31±0.5181/4MS0.566.72.472.882.20±0.6491/4MS1.073.73.713.322.18±0.66101/6MS0.163.33.003.031.54±0.72111/6MS0.555.82.532.351.46±0.66121/6MS1.042.12.342.101.43±0.67131/8MS0.161.52.782.851.48±0.66141/8MS0.547.62.122.211.46±0.74151/8MS1.040.31.352.031.28±0.56

注：表中健康指數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論與討論

不同類型的芽作為外植體對誘導(dǎo)萌發(fā)的影響較大，試驗發(fā)現(xiàn)，單純的使用頂芽無法誘導(dǎo)其萌發(fā)，外植體在培養(yǎng)一段時間后便褐化死亡，使用側(cè)芽萌發(fā)率較低，然而，使用帶有一個頂芽的側(cè)芽能取得較高的萌發(fā)率。這可能與頂芽的衰老及其細(xì)胞的程序性死亡使得植株的頂端優(yōu)勢受到抑制，激素隨之分配給側(cè)芽，促進(jìn)了側(cè)芽的萌發(fā)與生長[10-12]。

不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA的組合對于東亞唐棣組培苗的增殖影響較大，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，增殖系數(shù)加大，隨著NAA質(zhì)量濃度的加大，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在6-BA 3.0 mg·L-1與NAA 0.1 mg·L-1組合的條件下增殖系數(shù)較高，綜合情況較好,這與Pruski et al.[6]在榿葉唐棣中得出的結(jié)論較為相似；在6-BA 1.0 mg·L-1與NAA 0.2 mg·L-1組合的條件下，增殖系數(shù)較低，增殖苗基部切口處產(chǎn)生大量愈傷組織；在6-BA 2.0 mg·L-1與NAA 0.2 mg·L-1組合的條件下，健康指數(shù)最高，但增殖系數(shù)較小。

生根試驗結(jié)果表明，隨著無機鹽質(zhì)量濃度的降低，生根率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在1/4MS培養(yǎng)基上取得了較好的生根效果，這與杜保國[8]的研究結(jié)果較為相似。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為隨著大量元素的減少，植物體需要更多的根系吸收養(yǎng)分，從而提高了生根率；也可能是由于NH4NO3質(zhì)量濃度逐漸降低，減弱了對植物生根的抑制作用[13]，提高了生根率。隨著大量元素的繼續(xù)降低，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)下降，植物表現(xiàn)出生長不良的趨勢，從而降低了生根率。

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Tissue Culture System ofAmelanchierasiatica

Yin Pengxian, Cai Jing, Li Houhua, Melvin T T, Jiang Zaimin(Northwest A&F University, Yangling 712100, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(1)：54-56.

Amelanchierasiatica; Tissue culture; Proliferation; Rooting

尹鵬先，男，1990年6月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail: yinpengxian@126.com。

姜在民，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，副教授。E-mail:jiangzmz@163.com。

2014年5月11日。

Q943.1

1) 林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201204308)。

責(zé)任編輯：任 俐。