于秋菊，朱曉霞，王德才，孟志云，甘 慧，顧若蘭，吳卓娜，鄭 穎，李 儉，竇桂芳

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850)

125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的組織分布與代謝

于秋菊1,2，朱曉霞2，王德才1，孟志云2，甘 慧2，顧若蘭2，吳卓娜2，鄭 穎2，李 儉2，竇桂芳2

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850)

為研究125I-rAncrod(1.59 μg·kg-1)在Wistar大鼠器官和組織分布以及糞尿和膽汁的代謝情況，采用放射性125I標(biāo)記重組安克洛酶(125I-rAncrod)結(jié)合分子排阻色譜法(size exclusion chromatography,SEC)及γ-計(jì)數(shù)法測(cè)定不同時(shí)間組織及體液樣品中125I-rAncrod的含量。結(jié)果顯示，放射性藥物濃度主要累積在甲狀腺和胃腸道內(nèi)，肝腎次之，而腦、脊髓、脂肪、肌肉中藥物濃度一直處于較低的水平。Wistar大鼠尾靜脈注射125I-rAncrod后，SEC色譜圖顯示到48 h糞尿和膽汁中均檢測(cè)不到原形藥物。結(jié)果表明，大鼠尾靜脈注射125I-rAncrod后在全身各器官和組織分布廣泛，代謝較完全。

125I標(biāo)記重組安克洛酶；組織分布；代謝

安克洛酶特指從馬來西亞紅口蝮蛇(Malayan pit viper)蛇毒中分離純化出的類凝血酶[1]，為絲氨酸蛋白水解酶。重組安克洛酶(recombinant Ancrod，rAncrod)是采用基因工程技術(shù)將安克洛酶的基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)出來的糖蛋白，活性中心為絲氨酸，具有類凝血酶活性[2]。其相對(duì)分子質(zhì)量為38 000～44 000 D，碳水化合物含量約30%。重組安克洛酶為蛇毒類凝血酶制劑，特異性作用底物是纖維蛋白原，與凝血酶不同的是，只切割纖維蛋白原的α鏈，而不作用于β鏈。當(dāng)水解血漿纖維蛋白原α鏈中的Arg16-GLy位鍵時(shí)，能夠釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，由于蛇毒類凝血酶不激活凝血因子ⅩⅢ，生成的纖維蛋白單體不交聯(lián)形成堅(jiān)固的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易于被體內(nèi)的纖維蛋白水解酶所水解[3-4]，因此可以抑制血栓形成，具有降低血粘度、抑制紅細(xì)胞凝集、沉降、增強(qiáng)紅細(xì)胞的血管通過性及變形能力、降低血管阻力以及改善微循環(huán)等作用，使溶栓作用快速，缺血部位功能恢復(fù)，從而達(dá)到治療和防止復(fù)發(fā)的效果[5]。

安克洛酶自1966年上市，由于安克洛酶具有良好的溶栓作用[6,10-11]，因此各國曾多次開展臨床試驗(yàn)來研究安克洛酶對(duì)于缺血性卒中的療效。據(jù)報(bào)道，在北美開展的安克洛酶卒中治療試驗(yàn)(the stroke treatment with Ancrod trial，STAT)表明安克洛酶對(duì)發(fā)病3 h內(nèi)的急性缺血性卒中患者治療有效但會(huì)增加顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)[7]。安克洛酶在臨床試驗(yàn)中存在某些副作用，采用基因工程技術(shù)獲得了糖基化水平高、穩(wěn)定性好、毒性低的重組安克洛酶，可降低血中纖維蛋白原的含量，其作用機(jī)制與巴曲酶類似[8]。重組安克洛酶為大分子蛋白藥物，本實(shí)驗(yàn)擬采用放射性同位素示蹤法將125I標(biāo)記到重組安克洛酶的酪氨酸殘基上，并結(jié)合分子排阻色譜法來研究放射性藥物在大鼠體內(nèi)的組織分布情況，以及重組安克洛酶在尿樣及糞樣中可能的代謝產(chǎn)物，為臨床試驗(yàn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

凝膠過濾柱：ShodexOHpak SB-803 HQ，68 μm×300 mm，日本Shodex公司；高效液相色譜儀：LC-20T，SPD-20A，日本島津公司；自動(dòng)部分收集器：BS-100A，上海滬西分析儀器廠；γ計(jì)數(shù)儀：Wallac 1470 ，PerkinElmerTM公司；旋渦混懸器：GL-88B，海門其林貝爾儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋：HW·SY11-k(P1)，北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 藥品和試劑

rAncrod注射液：純度為100%，批號(hào)20140104-H3；Iodogen試劑：貨號(hào)T0656-250MG，批號(hào)101M4065，SIGMA-ALORICH公司；125I-rAncrod：放射性比活度為196.3 kBq·μg-1，放化純度為99.1%，北京北方生物技術(shù)研究所標(biāo)記和純化；三氯醋酸(TCA)：純度99%，批號(hào)20110913，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠：42只，雌雄各半，體重150～200 g，購自軍事學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0004。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)2012-0021。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 125I-rAncrod的標(biāo)記

采用Iodogen法標(biāo)記rAncrod，碘同位素在Iodogen試劑的催化作用下，將放射性碘標(biāo)記到rAncrod的酪氨酸殘基上。首先稱取Iodogen試劑1 mg溶于0.5 mL氯仿中，取50 μL(100 μg)加至試管底部，用氮?dú)獯蹈?，然后加rAncrod原液(蛋白含量為516 μg·mL-1)0.5 mL，再加入74 MBq的Na125I，室溫反應(yīng)10 min，反應(yīng)過程不斷搖動(dòng)，使反應(yīng)充分后分離純化。

將標(biāo)記反應(yīng)混合物通過1 cm×50 cm的Sephadex-G50凝膠柱上分離純化，洗脫液為0.2 moL·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，流速為1.0 mL·min-1。用部分收集器收集各時(shí)間段的洗脫液，采用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定γ放射性。

2.2 125I-rAncrod放化純度

用分子排阻色譜法(SEC)鑒定標(biāo)記物的純度。液相條件為：ShodexOHpak SB-803 HQ 凝膠過濾柱(68 μm×300 mm)，洗脫液為0.2 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)，流速1.0 mL·min-1。取10 μL125I-rAncrod手動(dòng)進(jìn)樣后用部分收集器每1 min收集一管，測(cè)定每管的γ放射性，計(jì)算色譜峰所占的總放射性百分比，即放化純度。

2.3 測(cè)定125I-rAncrod的方法學(xué)

取正常大鼠(4只)腦、胃、小腸、肝、脂肪、腎、心、膽汁、糞、尿等組織或體液，制成勻漿。加入4個(gè)不同濃度(1 511.7、151.2、30.2、6.0 ng/mL)的125I-rAncrod，每個(gè)濃度三個(gè)平行樣，樣品混勻后，加入等體積的20%TCA沉淀蛋白，測(cè)定各組織總放射性。5 000 r·min-1，離心5 min后取出上清，測(cè)定酸沉部分放射性。

2.4 125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的組織分布

受試品為125I-rAncrod，尾靜脈注射前用非標(biāo)記的rAncrod稀釋至2.75 μg·mL-1，藥物比活269.9 kBq·μg-1。Wistar大鼠24只，雌雄各半，每個(gè)性別隨機(jī)分為3組。組織分布研究采用尾靜脈注射給藥，給藥后化學(xué)劑量1.59 μg·kg-1(放射性比活度406.6 kBq·kg-1)。分別于靜脈注射0.25 、2 、6 h 后取眼眶靜脈血處死一組動(dòng)物，取血漿、血清、肝、腎、脾、肺、腎上腺、睪丸、卵巢、心臟、胰腺、胸腺、小腸、小腸內(nèi)容物、脂肪、膀胱、胃、胃內(nèi)容物、大腸、大腸內(nèi)容物、皮膚、脊髓、腦、肌肉及甲狀腺，共25種組織或體液。每種組織稱重、剪碎后，再加入1倍體積的20%的三氯醋酸(終濃度為10 %)沉淀蛋白，測(cè)定總活度，5 000 r·min-1離心5 min(血清、血漿8 000 r·min-1離心5 min)，吸棄上清，測(cè)定酸沉部分的活度[12-14]。

2.5 125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)代謝

Wistar大鼠6只，雌雄各半，尾靜脈注射給藥125I-rAncrod化學(xué)劑量1.59 μg·kg-1(放射性比活度229.0 kBq·kg-1)后單獨(dú)飼養(yǎng)在代謝籠內(nèi)，飼以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由飲水。收集給藥前和給藥后2、4、8、12、24、36、48 h的尿液及糞便，尿樣記錄總體積，糞便要稱重記錄總重量，所有采集的樣品于4 ℃下保存[9]。

Wistar大鼠8只，雌雄各半，戊巴比妥麻醉后做膽管插管，膽汁引流。待大鼠清醒后，尾靜脈推注給藥1.59 μg·kg-1(放射性比活度407.8 kBq·kg-1)后，收集不同時(shí)間段膽汁于4 ℃下保存。

取20 μL糞尿或膽汁樣品手動(dòng)進(jìn)樣后用部分收集器每1 min收集一管，共收集25管，測(cè)定每管的γ放射性，用放射性對(duì)洗脫體積作圖分析，洗脫液為0.2 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH6.8)，流速1.0 mL·min-1，測(cè)定125I-rAncrod的含量。

2.6 數(shù)據(jù)處理

在組織分布的研究過程中，用配對(duì)t檢驗(yàn)比較雌雄個(gè)體間是否存在顯著性差異。其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Microsoft Excel 2010及origin 7.5進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 125I-rAncrod的純度鑒定

標(biāo)記混合物經(jīng)凝膠過濾層析后得到一個(gè)放射性主峰，放射性主峰與非標(biāo)記rAncrod經(jīng)SEC分析，非標(biāo)記rAncrod的保留時(shí)間為7.057 min，125I-rAncrod的放射性主峰為第7管，即出峰時(shí)間為7.0 min，標(biāo)記物色譜圖示于圖1，圖1結(jié)果表明，洗脫出的放射性主峰為標(biāo)記蛋白，即125I-rAncrod。125I-rAncrod的放化純度為99.1%。

3.2 125I-rAncrod的方法學(xué)確證

不同組織中加入標(biāo)準(zhǔn)的125I-rAncrod后各組織參數(shù)值及酸沉率列于表1。

3.2.1 檢測(cè)方法的原理和特異性 標(biāo)準(zhǔn)125I-rAncrod是蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為38 000～44 000 Da的標(biāo)記蛋白，在10%TCA中原形125I-rAncrod的放射性主要存在于酸沉部分，125I-rAncrod在TCA酸沉淀部分的放射性酸沉率為加入放射性的(87.0±6.6)%(表1)。

3.2.2 靈敏度及可靠定量下限 方法靈敏度取決于125I-rAncrod的比活度、每次測(cè)定的樣品量和放射性測(cè)量時(shí)間，對(duì)低放射性樣品的測(cè)量時(shí)間適當(dāng)延長。該方法靈敏可靠，最低定量下限為6.0 ng/mL。

3.2.3 線性 不同組織或體液中加入125I-rAncrod，在1 511.7～6.0 ng/mL范圍內(nèi)加入量與總放射性和TCA沉淀放射性的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999(表1)。

3.2.4 酸沉率 不同組織或體液加入TCA后125I-rAncrod在TCA酸沉部分的放射性即酸沉率大于加入放射性的80%。提示在實(shí)驗(yàn)條件下125I-rAncrod主要存在于酸沉部分。

圖1 rAncrod(a)與125I-rAncrod(b)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of rAncrod (a) and 125I-rAncrod (b)

表1 不同組織中加入標(biāo)準(zhǔn)的125I-rAncrod后各組織參數(shù)值及酸沉率Table 1 Parameter values and acid precipitation rate of different tissue after adding the standard 125I-rAncrod

注：X指不同組織的理論活度，Y指各組織測(cè)得的總活度或者酸沉后的活度

3.3 125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的組織分布

Wistar大鼠尾靜脈注射1.59 μg·kg125I-rAncrod后不同時(shí)間各組織和體液內(nèi)的藥物濃度見表2。由表2可以看出，給藥后0.25 h各個(gè)組織中均能檢測(cè)到125I-rAncrod，說明該藥物能在大鼠體內(nèi)快速廣泛的分布；而且放射性主要集中在血液和肝臟中，甲狀腺和腎臟次之，腎臟內(nèi)放射性較高說明125I-rAncrod主要通過尿液排出體外。給藥2 h后甲狀腺的放射性達(dá)到最高，胃內(nèi)容物次之；胃腸內(nèi)容物中的藥物濃度較高，可能是由于藥物的堿性和酸性片段通過胃腸壁分泌入胃腸道。給藥后6 h除了甲狀腺以外，其他組織中的藥物濃度均已下降至較低的水平。此外，腦、脊髓、脂肪、肌肉中的藥物濃度一直較低，提示藥物不易進(jìn)入脂肪和肌肉，不易透過血腦屏障。

對(duì)相同組織性別間差異進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大部分組織的P大于0.05，表明125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的組織分布基本不存在性別差異。

3.4 125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的代謝

Wistar大鼠尾靜脈注射給藥后的色譜圖示于圖2，由不同時(shí)間點(diǎn)尿樣的色譜圖可以看出，主要是保留時(shí)間在16 min的小分子代謝產(chǎn)物，而且隨著時(shí)間的增長代謝物越來越少，到48 h尿樣基本已代謝完畢。12 h糞樣的色譜圖主要是在19 min出峰的小分子代謝產(chǎn)物。由圖3不同時(shí)間點(diǎn)膽汁的色譜圖看出，給藥后2 h，既有在7 min出峰的原形125I-rAncrod峰又有兩個(gè)小分子代謝產(chǎn)物峰，到48 h膽汁中的放射性基本已經(jīng)代謝完畢。

表2 Wistar大鼠尾靜脈注射1.59 μg·kg-1 125I-rAncrod后各組織中的125I-rAncrod濃度Table 2 Tissue concentration and AUC0-6h of 125I-rAncrod after single intravenous administration with 1.59 μg·kg-1 125I-rAncrod to Wistar rats

注：雌雄個(gè)體間不存在性別差異，P值絕大部分大于0.05。

圖2 Wistar大鼠尾靜脈注射1.59 μg·kg-1125I-rAncrod后不同時(shí)間點(diǎn)尿液和糞便的色譜圖Fig.2 Chromatograms of urine and feces after intravenous administration with 1.59 μg·kg-1125I-rAncrod to Wistar rats at different times

圖3 Wistar大鼠尾靜脈注射1.59 μg·kg-1125I-rAncrod后不同時(shí)間點(diǎn)膽汁的色譜圖Fig.3 Chromatograms of bile after intravenous administration with 1.59 μg·kg-1125I-rAncrod to Wistar rats at different times

4 結(jié)論

Wistar大鼠尾靜脈推注125I-rAncrod后，組織分布結(jié)果表明，藥物在大鼠體內(nèi)迅速廣泛分布，甲狀腺、肝臟、腎臟和胃腸道及其內(nèi)容物的放射性濃度比較高，經(jīng)過6 h各組織的放射性濃度明顯下降到較低的水平。代謝結(jié)果表明，大鼠給藥后糞尿中的放射性主要來源于原形125I-rAncrod的小分子代謝產(chǎn)物，膽汁中存在原形藥物和小分子代謝產(chǎn)物，到48 h糞尿和膽汁均已代謝完畢。

胃腸道中的藥物濃度較高，分析可能與標(biāo)記方法有關(guān)，酪氨酸是堿性氨基酸，胃液為酸性環(huán)境，代謝后的125I-酪氨酸或蛋白片斷可能通過胃壁分泌，導(dǎo)致胃腸道較高的放射性分布。

該研究建立了靈敏、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的同位素示蹤法來定量檢測(cè)重組安克洛酶在Wistar大鼠體內(nèi)的分布和代謝情況，為臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和給藥方案的制定提供了參考。

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Tissue Distribution and Metabolism of125I-rAncrod in Wistar Rats

YU Qiu-ju1,2, ZHU Xiao-xia2, WANG De-cai1, MENG Zhi-yun2, GAN Hui2, GU Ruo-lan2, WU Zhuo-na2, ZHENG Ying2, LI Jian2, DOU Gui-fang2

(1.TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;2.InstituteofTransfusionMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)

To study the tissue distribution and metabolism of radioactivity in rats after single intravenous administration of125I-rAncrod(1.59 μg·kg-1). The concentration of125I-rAncrod in various tissue and body fluids were determined by125I labeled rAncrod combined with size exclusion chromatography (SEC) and γ-counting methods. The concentration of125I-rAncrod predominantly accumulated in the thyroid and gastrointestinal and also be found in the kidney and liver in fair amounts, but in brain, spinal cord, muscle and fat was at a very low level. After single intravenous administration (chemical dose 1.59 μg·kg-1) of125I-rAncrod to Wistar rats, the samples of feces, urine and bile were analyzed by SEC. The result was that parent drug was not existed in feces, urine and bile in 48 h. The results showed that125I-rAncrod was distributed widely in rats, metabolic process was complete.

125I-rAncrod; tissue distribution; metabolism

10.7538/tws.2015.28.02.0107

2014-12-23;

2015-01-29

于秋菊(1990—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，藥理學(xué)專業(yè)

竇桂芳，博士，研究員，E-mail: douguifang@vip.163.com;王德才，教授，E-mail: dcwang@tsmc.edu.cn

TL92+3

A

1000-7512(2015)02-0107-06