張曉軍，劉 健，李云鋼，田嘉禾，張錦明

(解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853)

5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白顯像劑11C-DASB的自動化合成及Micro PET/CT顯像

張曉軍，劉 健，李云鋼，田嘉禾，張錦明

(解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853)

目的：自動化合成5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白顯像劑11C-DASB并進行大鼠Micro PET/CT顯像；方法：通過改變甲基化試劑、溶解前體溶劑及反應(yīng)條件，得到優(yōu)化的標(biāo)記條件作為碳-11多功能合成模塊的輸入?yún)?shù)，進行自動化合成11C-DASB，大鼠靜脈注射11C-DASB 45 min后進行顯像；結(jié)果：采用11C-CH3-Triflate作為甲基化試劑，通入新配制的含1 mg去甲基DASB前體的500 μL DMSO溶液內(nèi)，80 ℃下加熱2 min，標(biāo)準(zhǔn)率為63.7%，大鼠顯像表明，11C-DASB特異性的濃聚于SERT富集區(qū)域；結(jié)論：經(jīng)優(yōu)化，11C-DASB自動化合成可得到較高產(chǎn)率，大鼠顯像表明，其特異性濃聚于SERT富集區(qū)域，有望作為5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白顯像劑。

11C-DASB；5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白；Micro PET/CT

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，以5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)作為神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元廣泛的發(fā)散其末梢到中樞神經(jīng)系統(tǒng)各處，如前額皮質(zhì)、中腦腹側(cè)及背側(cè)紋狀體、黑質(zhì)等區(qū)域[1]，在各種調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵性作用，包括情感、動機、睡眠、食欲、疼痛等[2]。5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(serotonin transporter,SERT)是一種對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，位于神經(jīng)末梢突觸前膜，能間接反映五羥色胺神經(jīng)纖維末梢的數(shù)量，其功能異常將導(dǎo)致復(fù)雜的行為學(xué)異常及疾病，如抑郁癥、驚恐障礙、焦慮、強迫癥、神經(jīng)退行性病變、飲食紊亂等[3-6]。利用對SERT親和力強的PET顯像劑，可以從分子水平上研究轉(zhuǎn)運蛋白的功能，認(rèn)識SERT分布及密度變化與相關(guān)疾病病理的關(guān)系。2000年，Wilson等首先合成并研究了2-((2-((二甲基胺基)甲基)苯基)硫)-5-氰基苯胺(11C-DASB)，作為SERT顯像劑，11C-DASB能選擇性攝取于SERT感興趣區(qū)，具有高選擇性和高親和力(Ki=1.1 nm)[7]。11C-DASB的合成也得到發(fā)展，Wilson采用11C-CH3I與仲胺前體MASB反應(yīng)制備11C-DASB；Solbach等評價了不同合成條件對親核反應(yīng)的影響[8]；Belanger等利用11C-CH3-Triflate作為甲基化試劑合成11C-DASB[9]；Ungersboeck等探討了11C-CH3I和11C-CH3-Triflate作為甲基化試劑，MeCN和DMSO作為溶劑時對合成效率的影響，最終合成效率為(45.1±4.6)%[10]。本研究利用國產(chǎn)PET自動化碳-11多功能合成模塊制備了11C-DASB[11]，探討不同甲基化試劑、溶劑及反應(yīng)溫度對親核反應(yīng)的影響，并進行了大鼠腦部Micro PET/CT顯像研究。

1 實驗材料

HM-20 回旋加速器：日本住友重機械株式會社；PET 自動化碳-11多功能合成模塊，內(nèi)置液相碘代甲烷、Triflate在線轉(zhuǎn)換、甲基化和HPLC純化(配紫外和放射性檢測器)及固相萃?。号商乇本┛萍脊?；分析HPLC儀，配Biocan Flow Count放射性檢測器和2487紫外檢測器，Sep-Pak C-18：美國Waters公司；1 mol/L的氫化鋰鋁四氫呋喃溶液：德國，ABX公司；57%HI：AR, 美國Acros公司；乙醇：USP級，美國Milennium公司；丙酮和二甲亞砜(DMSO)：AR，美國Sigma公司；前體MASB：2-((2-((甲基胺基)甲基)苯基)硫)-5-氰基苯胺，標(biāo)準(zhǔn)品：12碳-2-((2-((二甲基胺基)甲基)苯基)硫)-5-氰基苯胺：江蘇常熟華益化工有限公司產(chǎn)品；eXPlore Vista小動物PET/CT成像系統(tǒng)：美國GE公司；正常Wistar大鼠： 6周齡，190 g北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 11C-碘代甲烷的合成

按文獻方法作部分改動[11]，HM-20加速器經(jīng)14N(p,α)11C反應(yīng)產(chǎn)生11C，在靶內(nèi)與氧氣反應(yīng)生成11CO2,直接將11CO2傳到合成器的LOOP環(huán)上，LOOP環(huán)浸于液氮內(nèi)。將LOOP環(huán)脫離液氮后經(jīng)空氣加熱，用40 mL/min的氮氣將LOOP環(huán)內(nèi)11CO2載帶到含0.2 mL 1 mol/L的氫化鋰鋁四氫呋喃溶液中，11CO2與氫化鋰鋁生成復(fù)合鹽，通入氮氣并加熱除THF。加入0.2 mL 57%氫碘酸，復(fù)合鹽水解并與氫碘酸反應(yīng)生成碳-11碘代甲烷，以40 mL/min流速通入氮氣并加熱，將11C-CH3I載帶出反應(yīng)管。

2.2 11C-碘代甲烷在線轉(zhuǎn)換11C-CH3-Triflate [12]

在不銹鋼管(10 mm×70 mm)內(nèi)，裝入0.4 g三氟甲基磺?；y與0.65 g石墨的混合物。通入氮氣，將之加熱到200 ℃。當(dāng)2.1節(jié)中11C-CH3I生成并由氮氣載出時，切換氣體三通，11C-CH3I通過該不銹鋼管，11C-CH3I在線轉(zhuǎn)換成11C-CH3-Triflate(圖1)。

圖1 合成11C-CH3-Triflate線路圖
Fig.1 Scheme of11C-CH3-Triflate synthesis

2.3 11C-DASB的標(biāo)記條件

采取不同的條件進行11C-DASB標(biāo)記，用丙酮或DMSO分別吸附11C-碘代甲烷或11C-CH3-Triflate，取出后與等體積的丙酮或DMSO溶解的前體MASB混合，前體最終濃度為2 g/L，反應(yīng)體積為0.5 mL，室溫放置2 min或80 ℃加熱2 min后取出用HPLC分析。

利用優(yōu)化的標(biāo)記條件，自動化合成11C-DASB：采用HM-20 回旋加速器，束流為40 μA，轟擊15 min，自動化合成11CH3I并在線生成11C-CH3-Triflate，將11C-CH3-Triflate通入到新配制含1 mg的去甲基DASB前體的500 μL DMSO溶液內(nèi)，常溫下反應(yīng)，觀察反應(yīng)瓶內(nèi)的放射性計數(shù)，待放射性計數(shù)達(dá)到最大，停止通入氣體。加熱反應(yīng)瓶80 ℃，維持2 min。將流動相加到反應(yīng)瓶終止反應(yīng)，并轉(zhuǎn)移到中轉(zhuǎn)瓶，將中轉(zhuǎn)瓶內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移到HPLC柱上純化，流動相為40%乙腈(0.1 mol/L乙酸銨)，流速為6 mL/min，收集10～12 min的液體入固相萃取瓶，固相萃取瓶中先注60 mL純水，以稀釋HPLC收集液。將經(jīng)稀釋的收集液轉(zhuǎn)移到Sep-Pak C-18柱上，10 mL水清洗后用1 mL乙醇將產(chǎn)品從柱上洗脫，并加生理鹽水稀釋。

圖2 合成11C-DASB線路圖Fig.2 Scheme of 11C-DASB synthesis

圖3 全自動合成11C-DASB的模塊Fig.3 The module of auto-synthesis for 11C-DASB

2.4 各組分的鑒別及放化純度的測量

分別將DMSO溶解的11C-碘代甲烷或11C-CH3-Triflate及標(biāo)記物用HPLC分析，測量條件：Waters的HPLC，2487紫外分光光度計，檢測波長：254 nm；515雙泵，分析柱為反相Nova-Park C-18柱(3.9 mm×150 mm)，Bio-Scan的Flow-Count放射性檢測器。流動相為40%乙腈(0.1 mol/L乙酸銨)，流速為1 mL/min。分別獨立進11C-碘代甲烷、11C-CH3-Triflate、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記物，以確定各組分的保留時間，并計算標(biāo)記率和放化純度。

2.5 11C-DASB的Micro PET/CT顯像

取正常Wistar大鼠，尾靜脈注射11C-DASB 74 MBq，于注射后45 min 將其置于掃描床上并持續(xù)異氟烷氣體麻醉，利用eXplore Vista Micro PET/CT進行掃描，先掃描PET再掃CT以定位，確定放射性濃集的部位。根據(jù)大鼠腦解剖位置，比較中腦、丘腦和小腦的放射性攝取。

3 結(jié)果與討論

3.1 各組份的鑒別

在分析HPLC上單獨進11C-CH3-Triflate時，其放射性峰的保留時間Rt=2.5 min；單獨進11C-CH3I時，其放射性峰的保留時間Rt=7.6 min；標(biāo)準(zhǔn)品DASB的紫外吸收峰Rt=5.7 min。常溫下11C-CH3-Triflate通入溶解去甲基前體DASB的DMSO溶液中，直接分析該溶液，其放射性HPLC圖譜示于圖4。

圖4 標(biāo)記物產(chǎn)物11C-DASB的HPLC圖譜Fig.4 The HPLC of 11C-DASB

圖4中，Rt=2.5 min和Rt=5.7 min的二個放射性峰分別為未反應(yīng)的11C-CH3-Triflate和標(biāo)記產(chǎn)物11C-DASB，同時圖中多了二個放射性峰，Rt=4.8 min 和Rt=11.2 min。從去甲基DASB的結(jié)構(gòu)分析，有兩個可甲基化的基團，一個是脂肪仲胺，該胺很活潑，中性條件下甲基化的產(chǎn)物為11C-DASB，從圖4可見甲基化率大于50%；另一個是芳香胺，采用11C-CH3-Triflate在中性條件下丙酮溶液中常溫較容易發(fā)生甲基化，如11C-PIB的合成即采用該條件；芳香胺甲基化后產(chǎn)品的脂溶性加大，在HPLC柱上保留時間后移，因此Rt=11.2 min的峰可能是芳香胺甲基化的副產(chǎn)品，而Rt=4.8 min的峰可能是季胺化的11C-DASB。

3.2 11C-DASB的標(biāo)記優(yōu)化

為優(yōu)化11C-DASB的標(biāo)記，分別采用不同的溶劑溶解前體以及分別用11CH3I和11CH3-Triflate為甲基化試劑，結(jié)果列于表1，利用11CH3I作為甲基化試劑，丙酮做溶劑時，11CH3I的離去基團為I-，其活性較弱，常溫與80 ℃加熱2 min時分別有90.1%和39.8%11CH3I未反應(yīng)，而在DMSO溶劑中，11C-DASB的合成效率提高，未反應(yīng)11CH3I殘留降低；11CH3-Triflate的離去基團為三氟甲磺酸根(Triflate-)，其離去能力強于I-，常溫與加熱反應(yīng)的標(biāo)記率分別為54.5%和63.7%，高于使用直接用11CH3I作甲基化試劑時的效率；加熱有助于親核反應(yīng)進行，明顯提高了反應(yīng)效率，盡管兩種副產(chǎn)物也隨之增加，但11C-DASB產(chǎn)率的增加顯著。因此，標(biāo)記條件確定為使用DMSO溶解前體，11CH3-Triflate為甲基化試劑并80 ℃加熱2 min。

表1 不同條件下11C-DASB的標(biāo)記產(chǎn)物分析Table 1 The lable of 11C-DASB under different circumstances

注：1) 化合物a為11C-CH3-Triflate，b為11C-DASB季胺化產(chǎn)物，c為11C-DASB，d為11C-CH3I，e為MASB苯胺甲基化產(chǎn)物

3.3 11C-DASB自動化合成

采用全自動合成模塊，使用以上優(yōu)化的條件，從11CO2開始，經(jīng)中性條件下的甲基化、加熱、Semi-prep HPLC純化、固相萃取，全自動合成了11C-DASB，時間為25 min。圖5為Semi-HPLC純化11C-DASB的放射性圖譜，在4～5 min之間出現(xiàn)一個放射性雜峰，這個雜峰可能為副產(chǎn)品，產(chǎn)品峰在11～12 min。最終得到3 GBq的11C-DASB，比活度為50 GBq/μmol。

圖5 半制備HPLC分離的放射性圖譜Fig.5 Radioactive chromatogram of semi-prep HPLC

3.4 11C-DASB的鑒別及放化純度的測定

經(jīng)HPLC分析，11C-DASB的放化純度大于99 %，紫外圖譜未見有前體存在。同時共進標(biāo)準(zhǔn)品的UV保留時間表明，放射性峰與標(biāo)準(zhǔn)品在HPLC上有相同的保留時間，證實放射性物質(zhì)為11C-DASB。

圖6 產(chǎn)品11C-DASB的HPLC圖譜Fig.6 Analytical HPLC profiles of 11C-DASB and 12C-DASB

3.5 11C-DASB的Micro PET/CT顯像

正常Wistar大鼠靜脈注射11C-DASB 約45 min在腦內(nèi)達(dá)到平衡，其Micro PET/CT顯像如圖7所示，A、B、C區(qū)域分別為丘腦、中腦和小腦，11C-DASB 選擇性的攝取于SERT區(qū)域丘腦和中腦，小腦的放射性攝取很低，中腦和小腦的攝取比為3.23，丘腦和小腦的攝取比為2.97。

4 小結(jié)

通過改變甲基化試劑、溶解前體溶劑及反應(yīng)溫度，并利用HPLC分析粗產(chǎn)品，得到優(yōu)化的標(biāo)記條件，利用國產(chǎn)PET 自動化碳-11多功能合成模塊，可自動化合成SERT顯像劑11C-DASB：采用11C-CH3-Triflate作為甲基化試劑，將此通入到新配制的含1 mg去甲基DASB前體的500 μL DMSO溶液內(nèi)，80 ℃下加熱2 min，標(biāo)記率提高至63.7%，而此前文獻報道11C-DASB的標(biāo)記率為22.7%～45.1%；大鼠的Micro PET/CT顯像表明，該顯像劑選擇性的濃聚于SERT富集區(qū)域，靶與非靶比高，有望作為良好的SERT顯像劑。

圖7 大鼠Micro PET/CT 顯像Fig.7 Micro PET/CT images of wistar rat

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Automatic Synthesis and Micro PET/CT Imaging Study of11C-DASB as a Serotonin Imaging Agent

ZHANG Xiao-jun, LIU Jian, LI Yun-gang, TIAN Jia-he, ZHANG Jin-ming

(DepartmentofNuclearMedicine,ThePLAGeneralHospital,Beijing100853 ,China)

Objectives: Automatic synthesis of11C-DASB as a serotonin imaging agent was established and Micro PET/CT imaging with Wistar rat was performed. Methods: Optimization of11C-DASB synthesis was established by modifying different11C-methylation agents, solvent and reaction conditions. Automated procedure for the synthesis of11C-DASB was established, and Micro PET/CT imaging was complied with Wistar rat. Results: The optimized11C-DASB synthesis was obtained. When11C-CH3-Triflate was used as methylation agent, 500 μL DMSO was used to dissolve 1 mg precursor, the reaction was carried out at 80 ℃ for 2 min, the radiochemical synthesis yield was 63.7%. Micro PET/CT studies in rat showed that the initial uptake of11C-DASB in the brain was high, especially in region of the highest density of SERT, such as colliculus and mid brain. Conclusion: The study should provide the basis for routine preparations of11C-DASB with high reliability, it may be useful for PET imaging of SERT binding sites in the brain.

11C-DASB; SERT; Micro PET/CT

10.7538/tws.2015.28.01.0001

2014-10-17;

2014-12-11

國家自然科學(xué)基金資助(81371593)

張曉軍(1987—)，男，福建泉州人，技師，主要從事放射性藥物合成與標(biāo)記

張綿明，男，研究員，E-mail: zhangjm301@163.com

R817

A

1000-7512(2015)01-0001-06