龔筱弦，范 佳，付希佳，趙 陽，宋 磊

缺血性腦血管疾病是當(dāng)今世界最常見疾病之一，致死、致殘率非常高且一直缺乏有效的治療手段。及時增加或恢復(fù)梗死區(qū)域的血流、保護缺血缺氧的神經(jīng)細(xì)胞是目前最常用的臨床治療方法。然而人為干預(yù)或自發(fā)的再灌注卻會使缺血所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)功能缺損進一步加重，給缺血性卒中的治療帶來新的難題。

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是體內(nèi)一種多肽鏈的細(xì)胞生長因子，可特異地調(diào)節(jié)粒系細(xì)胞的增殖和分化，并能增強成熟粒細(xì)胞的功能，對機體防御應(yīng)激或損傷有重要意義［1］。最新研究表明G-CSF 還可以對缺血再灌注神經(jīng)元起到保護作用。G-CSF 神經(jīng)保護作用機制復(fù)雜，目前認(rèn)為其可能的機制主要有抗凋亡、促進內(nèi)源性干細(xì)胞遷徙增殖及分化、抗炎以及促進血管生成等［2，3］。但至今其抗凋亡機制尚未完全闡明，也沒有G-CSF 對缺血再灌注后自由基和脂質(zhì)過氧化影響的相關(guān)研究與報道。

基于以上事實，本研究以缺血再灌注大鼠為模型，研究G-CSF 對體內(nèi)脂質(zhì)過氧化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，初步探討其可能的抗凋亡機制及抗自由基作用，為缺血性腦卒中提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性Wistar 大鼠24 只，體重250～300 g，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供。動物許可證號:SCXK(吉)2003-0002。隨機分成3 組:假手術(shù)組、對照組、G-CSF 治療組。GCSF 治療組于再灌注后2 h 后經(jīng)皮下按50 μg/kg 比例一次性注射粒細(xì)胞集落刺激因子;鹽水對照組注入等量生理鹽水;假手術(shù)組尼龍魚線插入僅10 mm，未阻斷血流，其余步驟同手術(shù)組，手術(shù)后不作任何干預(yù)性措施。

1.2 主要試劑 重組粒細(xì)胞集落刺激因子購自長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和丙二醛(Malonaldehyde，MDA)測試盒試劑盒購自南京建成生物工程研究所，磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogenactivated protein kinases，p-p38 MAPK)和磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)抗體購自Cell Signaling 公司，轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 缺血再灌注大鼠模型的制備 大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛(3.5 ml/100 g 體重)腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺，備皮常規(guī)消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，在手術(shù)顯微鏡下相繼暴露、分離右頸總動脈(common carotid artery，CCA)主干及分叉、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎并離段頸外動脈。用微動脈夾暫時夾閉CCA 主干近端和ICA 遠(yuǎn)端，在頸內(nèi)動脈近端備線，在ECA 近CCA 分叉3～5 mm 處剪一小口，將栓線插入，輕推尼龍線尾端經(jīng)ICA 入顱，阻力感比較明顯時停止插入，此時栓線準(zhǔn)確到達(dá)大腦前動脈起始段，栓線將阻斷進入大腦中動脈的血流，引起局灶性腦缺血改變;結(jié)扎ICA 備線，取掉微動脈夾;消毒棉球清潔手術(shù)野，逐層縫合;青霉素鈉鹽40000 U 腹腔注射，預(yù)防術(shù)后感染。1.5 h 后行再灌注，剪開縫合線，拔除栓線，縫合切口。共使用24 只大鼠，模型神經(jīng)系統(tǒng)評分采用Longa 評分法:無神經(jīng)功能缺損癥狀為0 分;提尾向下，不能完全伸展右側(cè)前爪為1 分;行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2 分;行走時向右側(cè)傾倒，行走困難為3 分;不能自發(fā)行走且意識水平下降為4 分;死亡為5 分。評分1～3 分為成功動物模型。

1.3.2 大鼠處死取材 再灌注24 h 后各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，以生理鹽水經(jīng)升主動脈灌注固定腦組織，0 ℃～4 ℃條件下快速斷頭取腦，取右側(cè)少量海馬組織稱重后，應(yīng)用冰冷的生理鹽水制備成10%組織勻漿置-40 ℃待測。余腦組織浸泡于4%多聚甲醛緩沖液24 h，用于病理觀察及免疫組化檢測。

1.3.3 脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進行腦組織中SOD、GSH-Px、MDA 和NO 的測定和計算。簡單步驟如下:(1)空白管中加入0.1 ml 的雙蒸水;標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.1 ml 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(100 μmol/L);測定管中加入10%腦組織勻漿0.1 ml。再于各管中加入試劑1:0.2 ml;試劑2:0.2 ml?；靹颍?7 ℃水浴60 min。(2)各管中再分別加入試劑3:0.2 ml;試劑4:0.1 ml。充分旋渦混勻30 s，室溫靜置10 min，離心10 min(3500 r/min)，取上清顯色。(3)各管中再加入上清液0.5 ml，顯色劑0.6 ml?；靹?，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm，1 cm 光徑，測各管OD 值。

計算公式:目標(biāo)物質(zhì)含量(μmol/mgport)=(測定管OD 值-空白管OD 值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管OD 值-空白管OD 值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷樣本的蛋白含量。

1.3.4 p38MAPK/JNK 免疫組化染色 取大鼠腦石蠟切片烤片、水化。經(jīng)抗原修復(fù)后，每張切片加1 滴或50 μl 過氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10 min，1 ×PBS 沖洗后血清封閉。除去血清，每張切片加1 滴1∶ 200 稀釋的一抗(p38MAPK/JNK 抗體)，4 ℃過夜。1 ×PBS 沖洗后每張切片加1 滴1∶1000 稀釋的生物素標(biāo)記二抗，室溫下孵育10 min，1×PBS 沖洗。每張切片加1 滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min。每張切片加2滴或100 μl 新鮮配制的DAB 溶液，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下(400 倍)每只大鼠切片選取大致相同部位5 個視野，數(shù)碼相機拍照并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 Tunel 染色測定神經(jīng)細(xì)胞凋亡 按照羅氏公司TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測程序行染色，具體過程如下:石蠟切片烤片、脫蠟后用Proteinase K 工作液處理組織(15～30 min，21 ℃～37 ℃)。再用PBS漂洗兩次，加入制備TUNEL 反應(yīng)混合液，孵育1 h后PBS 漂洗3 次，待玻片干后加50 μl converter-POD 于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)(37 ℃，30 min)。PBS 漂洗3 次，在組織處加50～100 μl DAB 底物，反應(yīng)15 ℃～25℃×10 min。PBS 漂洗3次后再用蘇木素復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS 或甘油在視野下，光學(xué)顯微鏡下(400 倍)每只大鼠切片選取大致相同部位5 個視野，數(shù)碼相機拍照并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 tMCAO 的建立及分組情況 使用了18只大鼠建立腦缺血再灌注模型，其中2 只于術(shù)后第1 天因蛛網(wǎng)膜下腔出血死亡，其余存活的16 只大鼠中，共15 例出現(xiàn)較為明顯的神經(jīng)功能損害，手術(shù)成功率為83.3%。共使用6 只大鼠建立假手術(shù)模型，術(shù)后6 只大鼠均存活。隨機分組后，對照組7 只大鼠，神經(jīng)系統(tǒng)評分:2.5 ±1.1;G-CSF 治療組8 只大鼠，神經(jīng)系統(tǒng)評分:2.6 ±0.9，兩組間無顯著性差異，肢體運動功能損害的模型在各組分布相對均衡。假手術(shù)組6 只假手術(shù)模型大鼠神經(jīng)系統(tǒng)評分為0 分。

2.2 再灌注區(qū)域SOD、GSH-Px 活性 與鹽水對照組相比，G-CSF 治療組SOD、GSH-PX 活性均顯著性升高(P ＜0.05)，但均低于假手術(shù)組(P ＜0.01)(見表1)。

2.3 再灌注區(qū)域MDA、NO 含量 與鹽水對照組相比，G-CSF 治療組MDA、NO 水平均顯著性降低(P ＜0.05)，但均高于假手術(shù)組(P ＜0.01)(見表2)。

2.4 再灌注區(qū)域p-p38MAPK 及p-JNK 陽性細(xì)胞 假手術(shù)組p-p38MAPK 及p-JNK 均無明顯表達(dá)，缺血再灌注后24 h，在鹽水對照組大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)及周圍區(qū)域即有p38MAPK 及JNK 大量磷酸化表達(dá)。治療組相比于對照組，陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯減少，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)(見表3)。

2.5 Tunel 染色計數(shù)凋亡細(xì)胞 假手術(shù)組未見明顯凋亡細(xì)胞。缺血再灌注后24 h，在鹽水對照組大鼠缺血皮質(zhì)及海馬均可見大量凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，胞體縮小，核膜皺縮，染色質(zhì)濃集于核膜附近，核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒和不規(guī)則固縮團塊，濃染呈棕褐色。治療組缺血區(qū)域凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(見表4)。

表1 各組SOD 和GSH-PX 活性比較()

表1 各組SOD 和GSH-PX 活性比較()

表2 各組MDA 和NO 含量比較()

表2 各組MDA 和NO 含量比較()

表3 各組p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細(xì)胞數(shù)比較()

表3 各組p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細(xì)胞數(shù)比較()

表4 各組TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡數(shù)()

表4 各組TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡數(shù)()

3 討論

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是抗氧化酶系統(tǒng)中最重要的成員，與抗氧化劑如輔酶Q、VitE 等共同作用，使自由基產(chǎn)生與清除兩方面處于動態(tài)平衡。但發(fā)生缺血再灌注時氧自由基大量生成，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)不足以清除過多產(chǎn)生氧自由基造成初始缺血損傷并不嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷或凋亡從而加重神經(jīng)功能缺損［4，5］。本實驗發(fā)現(xiàn)GCSF 可以使抗氧化酶的活性增加，主要表現(xiàn)在治療組大鼠缺血區(qū)域SOD 及GSH-PX 水平明顯高于對照組(P ＜0.05)。雖然G-CSF 可以增加治療組大鼠腦內(nèi)SOD 及GSH-PX 活性，但這種作用是否能夠有效得體現(xiàn)在對抗體內(nèi)的氧化應(yīng)激呢?脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation，LPO)反應(yīng)是指自由基與不飽和脂肪酸氧化分解成各種代謝產(chǎn)物即過氧化脂質(zhì)的連鎖反應(yīng)過程［6］。因此脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛(malondialde-hyde，MDA)、4-羥 基 壬 烯 醛(4-hydroxynonenal，HNE)和丙烯醛的水平間接的反映了體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度，被認(rèn)為可以作為衡量氧化應(yīng)激的生物學(xué)指標(biāo)［7］。在本次實驗中，選取其中最常用的生成期產(chǎn)物MDA 作為測量指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)相對于對照組，治療組大鼠腦內(nèi)MDA 水平明顯下降，充分表明G-CSF 不僅僅是單純增加抗氧化酶的活性，其在體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激作用也是確切存在的。

本次實驗還測定了3 組大鼠腦內(nèi)一氧化氮(nitric oxide，NO)的水平。在腦缺血及再灌注損傷中，NO 有著重要的作用。缺血后期由神經(jīng)細(xì)胞中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化產(chǎn)生的NO 則具有神經(jīng)毒性作用，使腦缺血損傷程度加重［8］。有研究表明，炎癥時G-CSF 可以通過抑制NOS 的表達(dá)降低肺泡內(nèi)皮細(xì)胞中NO 的含量［9］，但是否在神經(jīng)細(xì)胞中也有相似作用尚無明確報道。本次研究發(fā)現(xiàn)治療組NO 水平明顯低于對照組，說明CSF 同樣可以降低缺血晚期神經(jīng)細(xì)胞中的NO 含量而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

除了被認(rèn)為是G-CSF 抗凋亡的主要途徑-JAKs-STATs 途徑外，Kamezaki 等人認(rèn)為G-CSF 還能通過其他的蛋白酪氨酸激酶如胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等 發(fā) 揮 作用［10］。ERK 是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族中的一員。MAPK 超家族廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，是一族含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核，引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)［11］。除了ERK，MAPK 家族中還包含c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、ERK3/4 和ERK5 等亞家族，被認(rèn)為參與缺血再灌注損傷中細(xì)胞的損傷和修復(fù)的調(diào)控［12～14］。本次即選取了其中兩個重要的途徑:p38MAPK 途徑和JNK 途徑，進一步研究G-CSF 發(fā)揮抗凋亡作用的可能機制。

當(dāng)腦缺血再灌注后，大量生成的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白介素1(interleukin 1，IL-1)、過氧化氫、谷氨酸等激活p38MAPK 和JNK 信號通路，生成的活性形式也即磷酸化的p-p38MAPK 和p-JNK，通過激活c-jun蛋白和c-fos 蛋白、誘導(dǎo)bax 蛋白轉(zhuǎn)位、介導(dǎo)半胱天冬酶(caspases)活化、磷酸化p53 等介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［15］。關(guān)于G-CSF 對缺血再灌注后p38MAPK和p-JNK 途徑的影響，尚未見報道。本次研究中發(fā)現(xiàn)G-CSF 治療組大鼠缺血腦組織中p-p38MAPK 和p-JNK 陽性細(xì)胞較對照組明顯減少，并有顯著性差異。G-CSF 抗p38MAPK 和p-JNK 途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和兩者的抑制劑作用不同，其主要作用是減少p38MAPK 磷酸化，至于是否還可以通過拮抗p38MAPK 下游途徑還有待于進一步研究。另外，p38MAPK 途徑還可以與LPO 反應(yīng)相互影響，在缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。Park 等研究發(fā)現(xiàn)用p38MAPK 抑制劑可以降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性和NO 水平，提示p38MAPK 信號通路參與缺氧介導(dǎo)的NO 生成［16］。因此通過本實驗結(jié)果，我們推測拮抗p38MAPK 途徑可能是G-CSF 減少NO 的產(chǎn)生的機制之一。

實驗的最后我們還對所有的大鼠模型進行了tunel 染色以驗證G-CSF 的神經(jīng)保護作用。發(fā)現(xiàn)在治療組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯少于對照組。綜上，我們認(rèn)為G-CSF 可以顯著降低大鼠缺血再灌注后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、拮抗JNK 和p38MAPK 途徑，并可能以此為作用機制之一，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)功能缺損。

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