付婷婷，孔慶霞，盛華強，高凌云

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，約30%為難治性癲癇，其中大多數(shù)為顳葉癲癇。手術(shù)成為治療難治性癲癇的首選，其關(guān)鍵在于致癇灶的定位。美國癲癇協(xié)會和神經(jīng)疾病及中風國家研究所認為AMT 是公認的癲癇替代標記物［1］，其在癲癇灶中具有高攝取的特點。Kaqawa 等［2］采用PET 技術(shù)發(fā)現(xiàn)在結(jié)節(jié)性硬化患兒致癇灶內(nèi)，切除高AMT 代謝區(qū)后，可達到癲癇發(fā)作停止效果。本研究利用AMT 這一特性和超順磁性納米粒子的各種優(yōu)勢，將AMT 錨定到MNP 上形成靶向納米探針，嘗試對急性顳葉癲癇模型病灶的定位研究。

1 材料和方法

1.1 磁性納米粒子 結(jié)構(gòu)上我們遵循類似于Akhtari M［3］描述的制作納米粒子的過程，使用核心為γ-Fe2O3 納米晶體，外表為葡聚糖包被。使其平均直徑約20 nm，并將濃度標定至2.4 mg Fe/ml。靶向納米探針是在以上相同尺寸和表面的MNP 的基礎(chǔ)上，通過磁性分離凈化、洗滌、再分散而得，然后將AMT 與功能性的MNP 共價連接。螯合AMT 的MNP 由德國Micromod 公司提供。其濃度標定至2.4 mg Fe/ml，氨基酸密度5 nmol/mg Fe。

1.2 癲癇模型的建立及分組 實驗動物健康雄性Sprague Dawley 大鼠50 只，體重200～250 g，由山東魯抗實驗動物中心提供(生產(chǎn)許可證scxk 魯20130001)。將大鼠腹腔注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg，18～20 h 后給予溴化甲基阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min 后腹腔注射匹羅卡品(Pilocarpine)30 mg/kg，給藥后根據(jù)Racine 分級密切觀察大鼠行為學改變評估癲癇發(fā)作程度。若注射匹羅卡品后30 min仍未出現(xiàn)IV～V 級癇性發(fā)作，則可補充少量的匹羅卡品，一般間隔10～15 min，每次劑量為10 mg/kg，最大追加劑量不得超過60 mg/kg。持續(xù)癇性發(fā)作(Racine 5 級以上)為成功模型，1 h 后，給予地西泮10 mg/kg 腹腔注射。如不能緩解癇性發(fā)作，可給予10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)，直到癇性發(fā)作被解除，之后可給予腹腔注射葡萄糖給予能量支持。

造模成功且存活的45 只大鼠按照隨機原則分為Saline 對照組(n=15)、P-MNP 對照組(n=15)、AMT-MNP 組(n=15)。對死亡的癲癇模型大鼠按隨機抽樣原則作及時補充。

Racine 行為學分級標準:0 級:精神狀態(tài)良好、行為正常，無抽搐動作;Ⅰ級:頭面部短暫、不自主抽動，如眨眼、須動、咀嚼等，伴有目光呆滯、眼球充血;Ⅱ級:全身不自主顫動、節(jié)律性點頭，可伴有前肢抓撓動作;Ⅲ級:一側(cè)前肢短暫性、局限性肌陣攣;Ⅳ級:雙側(cè)前肢陣攣、抬起，后肢直立;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發(fā)作，因全身肌肉強直而站立，并失去體位控制、跌倒。

1.3 磁共振掃描動物研究 采用西門子3.0T超導型MR 掃描儀，配合使用3 英寸環(huán)形線圈。于癲癇模型癲癇大發(fā)作后的72 h 分別進行尾靜脈注射AMT-MNP(15 mg/kg)、P-MNP(15 mg/kg)、生理鹽水(等量)［4］。在注射前，注射后2～6 h 或24 h分別進行MR 掃描。掃描時用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，水平趴在線圈上方并固定，使線圈的中心與大鼠體部及磁場的中心保持一致。掃描序列為:T2sequences，2500TR/TE70，F(xiàn)OV 80 mm，層 厚2.0 mm，片層12，掃描時間6.50 min。癲癇灶橫軸面T2馳豫時間數(shù)值測量采用T2map 序列，我們使用T2mapping 軟件計算T2馳豫時間數(shù)值。

1.4 病理組織學檢查

1.4.1 腦組織冰凍切片 MRI 后的SD 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。待麻醉后，仰臥固定、備皮，剪開胸腔并迅速將針頭從左心尖插入，進入到升主動脈內(nèi)，剪破右心耳，先用冷生理鹽水快速灌注(約30 min)，再換成4%多聚甲醛灌流。灌注充分后斷頭取腦，將其浸到4%多聚甲醛中后固定，移入30%的蔗糖浸泡沉底，行與大腦MRI 時致癲灶位置吻合位置的冰凍連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm，行組織病理學染色。

1.4.2 普魯士藍鐵染色Perl's iron stain 將冰凍切片復溫、涼干，蒸餾水沖洗3 min;入Perls stain，浸染15～30 min;蒸餾水2～5 min;入核固紅染色液5～10 min;自來水沖洗1～5 s;常規(guī)脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進行圖像采集。

1.4.3 尼氏染色Nissl Staining 將冰凍切片復溫、涼干;0.01 mol PBS 洗3 次;將切片置于水浴加熱至60 ℃的0.5%甲苯胺藍水溶液5～10 min，蒸餾水沖洗;70%酒精浸泡2 min，置于95%酒精中分色;置于100%酒精3 次，每次1 min;二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進行圖像采集。

1.4.4 Fluoro-Jade B 染色 將冰凍切片復溫、涼干;含1% NaOH 的80% 酒精溶液搖洗5 min;70%的酒精溶液浸泡2 min，蒸餾水2 min;0.06%高錳酸鉀中震蕩10 min，蒸餾水2 min;放入0.0004%的FJB 工作液，室溫避光染色20 min，蒸餾水3 次，每次1 min;去除多余水分后，50 ℃～60 ℃烘烤15～30 min;浸入二甲苯透明2 min，用中性樹膠封片，熒光顯微鏡下采用藍色激發(fā)光(波長為450～490 nm)觀察及圖像采集。

1.5 統(tǒng)計學處理 本實驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)中，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示，組間比較用oneway ANOVA 分析，兩兩之間的比較使用LSD 檢驗。T2數(shù)值組內(nèi)給藥前后比較采用配對t 檢驗。P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇模型磁共振掃描 T2序列結(jié)果顯示病灶高信號，多位雙側(cè)，每只大鼠我們選擇肉眼觀察明顯的一側(cè)進行統(tǒng)計分析。給藥前3 組之間的致癇灶T2值差異無顯著性(P ＞0.05)。經(jīng)注射后各組分別與給藥前比較，Saline 組大鼠T2信號差異無顯著性(P ＞0.05)，P-MNP 組致癇灶局部輕度變暗，T2值差異無顯著性(P ＞0.05)，AMT-MNP 組致癇灶T2信號明顯變暗，T2值顯著下降，有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 普魯士藍染色觀察鐵粒子在大鼠腦內(nèi)的分布 鏡下可見，AMT-MNP 組和P-MNP 組腦組織內(nèi)均有藍棕色顆粒分布，與Saline 組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。其中AMT-MNP 組分布較多，有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。發(fā)現(xiàn)鐵顆粒多數(shù)分布在神經(jīng)元細胞漿內(nèi)，極少數(shù)分布在細胞周圍。Saline 組未有藍棕色顆粒分布(見表2、圖2)。

2.3 尼氏染色觀察模型大鼠海馬神經(jīng)元缺失鏡下可見3 組海馬CA3區(qū)海馬神經(jīng)元都出現(xiàn)尼氏染色著色淺，尼氏小體少，可見大量的異常形態(tài)的神經(jīng)元，細胞體積變小，呈三角形或不規(guī)則形態(tài)，胞核與胞裝分界不清，尼氏染色陽性細胞計數(shù)少;3 組在數(shù)量及形態(tài)上無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)(見表3)。

2.4 FJB 染色觀察急性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷 鏡下發(fā)現(xiàn)，3 組海馬CA3區(qū)都出現(xiàn)大量FJB 陽性神經(jīng)元，與尼氏染色的缺失部位相對應(yīng)，CA1區(qū)的FJB陽性神經(jīng)元相對較少。3 組比較FJB 陽性神經(jīng)元數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)(見表4)。

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2值變化()

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2值變化()

給藥前組間比較P ＞0.05;與給藥前比較* P ＜0.05;與給藥前比較#P ＞0.05

表2 3 組大鼠腦組織鐵顆粒分布數(shù)目()

表2 3 組大鼠腦組織鐵顆粒分布數(shù)目()

與Saline 組比較* P ＜0.05;與Saline 組比較#P ＜0.01;與PMNP 組比較ΔP ＜0.01

表3 尼氏染色各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目()

表3 尼氏染色各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目()

與Saline 組比較* P ＞0.05;與P-MNP 組比較#P ＞0.05

表4 FJB 染色各組大鼠海馬CA3區(qū)FJB 陽性細胞數(shù)()

表4 FJB 染色各組大鼠海馬CA3區(qū)FJB 陽性細胞數(shù)()

與Saline 組比較* P ＞0.05;與P-MNP 組比較#P ＞0.05

3 討論

難治性顳葉癲癇的早期靶向定位與診斷是近年來癲癇領(lǐng)域研究的熱點，是提高患者生存率、改善生活質(zhì)量的關(guān)鍵所在。隨著分子影像學的深入研究以及納米粒子制備技術(shù)的不斷發(fā)展，功能性MNP 在磁共振成像技術(shù)下進行病變部位的靶向檢測已經(jīng)深入神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我們設(shè)想通過匹羅卡品誘導顳葉癲癇模型，注射AMT-MNP 后經(jīng)MRI 掃描，探討其對于顳葉癲癇急性期致癇灶的靶向定位與早期診斷價值。我們發(fā)現(xiàn)功能性MNP 能夠在癲癇大鼠MRI 上表現(xiàn)出特定的腦區(qū)域。影像學結(jié)合組織病理學證實，MNP 能夠透過急性期癲癇模型大鼠BBB［5］。其原因可能是多方面的，首先，癲癇本身所致的炎癥反應(yīng)就會改變BBB 的功能，如破壞緊密連接的完整性，可增強血管內(nèi)皮細胞胞飲作用等。Michalak Z等通過研究就發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后BBB 通透性增加［6］。其次，可能與MNP 本身特有的納米效應(yīng)(微小尺寸)有關(guān)。此外，MNP 的超順磁性特性在MR中表現(xiàn)出的獨特的功能也是原因之一。然而MNP能否通過正常腦組織BBB 仍需要進一步研究。本實驗還發(fā)現(xiàn)注射AMT-MNP 后其可被腦實質(zhì)攝取，并在致癇灶中呈現(xiàn)信號負增強。由于MNP 的超順磁性在外加磁場的作用下，強烈地影響顆粒周圍的水分子中氫質(zhì)子的弛豫過程，同時能更為有效地縮短T2時間，因此超順磁納米顆粒使病灶表現(xiàn)出信號負增強變化［7］。我們比較了注射生理鹽水、P-MNP和AMT-MNP 后對癲癇灶MRI 的強化效果，發(fā)現(xiàn)Saline 組致癇灶T2WI 信號無明顯改變，而P-MNP 組和AMT-MNP 組有不同程度的下降。比較之下，AMT-MNP 組信號下降明顯，表現(xiàn)出其對致癇灶的靶向性。原因是在癲癇病理情況下，AMT 通過犬尿氨酸路徑代謝致使致癇灶高攝取AMT，從而提高了氧化鐵納米粒子的有效結(jié)合，使更多的鐵顆粒滯留在致癇灶內(nèi)。對于P-MNP 而言，致癇灶對其也有一定的結(jié)合和攝取，可能和癲癇中BBB 的通透性有所增加以及MNP 的超順磁性有關(guān)。普魯士藍染色顯示鐵顆粒在與MRI 掃描相應(yīng)的致癇灶中聚集，AMTMNP 組鐵顆粒的聚集較P-MNP 組多，這就與MRI掃描T2WI 值的變化結(jié)果一致，進一步的支持我們的假設(shè)。尼氏染色和FJB 染色結(jié)果顯示致癇灶中海馬神經(jīng)元的缺失情況，將3 組結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)注射功能性MNP 后，致癇灶神經(jīng)元的病理變化并無顯著改變，間接表明MNP 在腦組織內(nèi)無明顯毒性作用。關(guān)于這些粒子在人體內(nèi)的新陳代謝，藥理學研究表明這些MNP 的鐵分子通過溶酶體溶解，葡聚糖則主要通過腎臟排泄［8］。Muldoon 等［9］則做了磁性納米粒子的毒理學研究，發(fā)現(xiàn)這些粒子并未使動物腦細胞發(fā)生病理變化以及髓鞘的改變。我們相信隨著納米生物等技術(shù)的發(fā)展，MNP 必將會顯示出更小的毒副作用從而為其臨床應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。綜上所述，功能性的MNP 作為一種新型的MRI 對比劑，可以透過BBB 并在急性癲癇致癇灶內(nèi)顯像，AMTMNP 明顯降低急性癲癇的MRI T2信號強度，起到了靶向定位致癇灶的作用，為靶向納米探針可用于臨床對疾病的定位、診斷及治療奠定了基礎(chǔ)。初步證實了功能性MNP 對腦組織無明顯毒副作用，為臨床應(yīng)用提供了安全保障。但是本實驗沒有就納米探針對緘默期及慢性期癲癇在MRI 的顯像進行研究，而且本實驗只是對少量樣本進行研究，所以仍需要更深入的研究。

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圖1 急性期癲癇模型大鼠的磁共振T2加權(quán)圖像

圖2 各組急性癲癇模型大鼠普魯士藍染色情況