尉 娜，趙建華，李 娟，譚 軍

缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重危害人們身體健康的常見病、多發(fā)病，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的不可逆性損害是臨床難以取得滿意療效的主要原因，通過缺血預(yù)處理能對大腦具有保護(hù)作用，為研究內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)治療方法提供了新的研究方向。本實驗中我們選用腺苷作為預(yù)處理的藥物，通過對大鼠腦缺血再灌注模型進(jìn)行腺苷預(yù)處理，觀察Wnt1 蛋白的表達(dá)情況，來探討腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的機(jī)制，從而為腺苷應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康SD 大鼠224 只(雄性，體重250～300 g)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(F 組)、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組(AF 組)、缺血再灌注組(IR 組)、和腺苷預(yù)處理組(AP 組)共4 組，每組根據(jù)再灌注時間隨機(jī)分為1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 5 個亞組。F 組和IR組大鼠術(shù)前3d 開始每天腹腔注射生理鹽水2 ml;AF 和AP 組大鼠術(shù)前3 d 開始每天腹腔注射腺苷注射液，劑量為1.5 mg/kg，生理鹽水稀釋到2 ml。

1.2 主要試劑 腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20030320、規(guī)格:6 mg/2 ml)，兔抗大鼠Wnt1 蛋白抗體(1∶ 100)、即用型SABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Nikon MODEL YS100顯微鏡(Nikon)，照相顯微鏡HPIAS-2000 顯微圖像定量分析系統(tǒng)(鄭州太陽電子科技公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立本實驗采用尼龍線栓塞法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型［1，2］，阻斷MCA 2 h 后，輕輕向外抽拉尼龍線至頸外動脈主干，大腦動脈Willis 環(huán)和MCA 已恢復(fù)血供，保持體溫至清醒。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，并給予抗生素及補(bǔ)液治療。

1.3.2 神經(jīng)功能缺失評分 各組大鼠處死取材前均應(yīng)用Zea Longa［3］的5 分制法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分，求其平均值作為該大鼠神經(jīng)功能得分。評分標(biāo)準(zhǔn):0 分:沒有神經(jīng)功能的缺損癥狀;1分:對側(cè)前上肢不能伸展完全;2 分:行走時上肢不能伸展完全;3 分:行走時向病灶對側(cè)傾倒;4 分:陷入意識喪失狀態(tài)。實驗納入標(biāo)準(zhǔn)為1～3 分，排除標(biāo)準(zhǔn)為0 分或4 分。

1.3.3 Western blotting 檢測Wnt1 蛋白的表達(dá)

1.3.3.1 檢測Wnt1 蛋白濃度 分別取各組大鼠5 只，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，立即冰上斷頭取右側(cè)海馬按1∶ 9 加入勻漿緩沖液，冰上裂解、勻漿。4 ℃低溫離心機(jī)15000 r/min，離心30 min。取 上 清 分 裝 至EP 管 中，每 管50 μl，-80 ℃冰箱保存。按照BCA 蛋白濃度的測定試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測所得樣品，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品的濃度值。

1.3.3.2 Wnt1 蛋白免疫印跡 將所得樣品與緩沖液按體積比4∶ 1 混勻，于100 ℃沸水中加熱5 min，取出后行30 s 的低速離心，靜置備用。取出膠板上的加樣梳，組裝電泳裝置，加入電泳緩沖液，加樣電泳，濃縮膠范圍內(nèi)電壓60 V，跑至分離膠后電壓改為120 V，待與所需的目的及內(nèi)參蛋白相應(yīng)位置的Marker 完全跑開時停止電泳。按照電轉(zhuǎn)儀的陽極-3 層濾紙-PVDF 膜-膠-3 層濾紙-電轉(zhuǎn)儀的陰極順序放置，保證55 min 的條件轉(zhuǎn)目的蛋白所在的膜(0.45 μm);以2 mA/cm2，90 min 的條件轉(zhuǎn)內(nèi)參蛋白所在的膜(0.45 μm)。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液室溫封閉1 h。加入兔抗大鼠Wnt1 蛋白抗體(1∶ 100)，或兔抗鼠β-actin 抗體(1∶ 2000)4 ℃孵育過夜?；厥找豢?，取出PVDF 膜，TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。在室溫下相應(yīng)加入山羊抗兔IgG 抗體孵育2 h，TBST溶液洗膜3 次，每次5min。隨后用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，數(shù)值變量資料的組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著差(LSD)t 檢驗，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評分結(jié)果 對各組不同再灌注時間點大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失行為學(xué)評分。F、AF 組大鼠評分為0 分。IR、AP 組大鼠均有不同程度神經(jīng)功能缺失癥狀，AP 組大鼠相應(yīng)時間點的神經(jīng)功能評分均較IR 組低，相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)，IR、AP 組均隨著再灌注時間的延長，神經(jīng)功能評分呈逐漸降低趨勢，推測可能與大鼠自我修復(fù)能力有關(guān)(見表1)。

2.2 Wnt1 蛋白免疫印跡結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)、AF 組Wnt1 幾乎不表達(dá);IR、AP 組Wnt1 蛋白隨著缺血再灌注時間的延長，表達(dá)均逐漸增加，于再灌注7 d 時達(dá)到最高峰。與前兩組相比，IR、AP 組Wnt1表達(dá)的增加比較明顯(P ＜0.01)，且AP 組比IR 組表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.05)(見表2)(見圖1～圖3)。

表1 各組不同再灌注時間點大鼠神經(jīng)功能缺失評分()

表1 各組不同再灌注時間點大鼠神經(jīng)功能缺失評分()

與IR 組比較* P ＜0.05

表2 局灶性腦缺血對大鼠海馬Wnt1 表達(dá)的影響()

表2 局灶性腦缺血對大鼠海馬Wnt1 表達(dá)的影響()

與F 組、AF 組比較* P ＜0.01;與IR 組相比較#P ＜0.05

圖1 不同時間點IR 組大鼠Wnt1 蛋白免疫印跡結(jié)果。β-actin為內(nèi)對照

圖2 不同時間點AP 組大鼠Wnt1 蛋白免疫印跡結(jié)果。β-actin 為內(nèi)對照

圖3 不同時間點各組局灶性腦缺血再灌注大鼠Wnt1 蛋白表達(dá)與F 組、AF 組相比▲P ＜0.01;與IR 組相比★P ＜0.05

3 討論

隨著老齡化時代的到來，腦血管疾病是當(dāng)今人類的三大死因之一，在我國居于首位，尤以缺血缺氧性腦血管病最常見［1］，其高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率給患者、家庭及社會帶來了極大的痛苦和負(fù)擔(dān)。雖然目前人們對其病理機(jī)制進(jìn)行了深入研究發(fā)現(xiàn)，其病理過程是一個多因素、多機(jī)制，涉及復(fù)雜的時間和空間的級聯(lián)反應(yīng)［2，3］，但有效的治療手段還沒有取得突破性進(jìn)展。腦缺血損傷后神經(jīng)元的死亡不可避免，如何替補(bǔ)受損神經(jīng)元進(jìn)而恢復(fù)腦功能是目前治療難點和熱點。

Anderson［4］等于1989 年首次證實了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的存在，NSCs 是一種原始細(xì)胞，具有自我更新潛能及多方向分化的能力，于是如何激活NSCs 進(jìn)而利用NSCs 生物潛能達(dá)到治療作用成了學(xué)者們研究的熱點。成年的哺乳動物NSCs，大部分存在于腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和顆粒下層(subgranular zone，SGZ)［5，6］。NSCs 進(jìn)行自我更新和多方向分化的潛能(干性的維持)的機(jī)制非常復(fù)雜，目前其確切的機(jī)制仍不清楚。總體來說，NSCs 的干性維持受到內(nèi)源因子調(diào)控，常見因子包括Wnt、Notch、Hes 等信號通路及轉(zhuǎn)錄因子，同時它也受到外源性信號調(diào)控，常見外源信號是圍繞在NSCs 周邊的細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞等所謂的微環(huán)境［7～13］。

Wnt 蛋白是成體干細(xì)胞的外源性調(diào)控因子，是控制動物胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運及組織器官形態(tài)形成的重要信號通路之一［14］。當(dāng)Wnt 信號途徑激活時，Wnt 蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［15］。近年來，Wnt 信號通路調(diào)控NSCs 增殖、分化的作用越來越受到廣泛的關(guān)注。邢雪松［16］等發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血再灌注時Wnt1 的時間依賴性表達(dá)與NSCs 的增殖過程相吻合。Chen BY［17］等研究表明，應(yīng)用Wnt 信號通路特異性阻斷劑IWR1 后，BDNF 對NSCs 增殖、分化的促進(jìn)作用受到顯著抑制。這些均說明NSCs 的增殖與Wnt 信號通路有著重要的聯(lián)系。本課題組先前研究證明，缺血再灌注損傷后會引起腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，在腺苷預(yù)處理干預(yù)后其增殖明顯增加。本試驗發(fā)現(xiàn):假手術(shù)組與腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組大鼠腦組織Wnt1 蛋白表達(dá)極低;缺血再灌注組與腺苷預(yù)處理組Wnt1 蛋白的表達(dá)隨著缺血再灌注時間的延長，均明顯增加(P ＜0.01)，腺苷預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，差異具有顯著性(P ＜0.05)。參照Nestin 免疫組化結(jié)果，Wnt1 測定的時間窗與內(nèi)源性NSCs 增殖相一致，說明Wnt 信號通路分子在內(nèi)源性NSCs 增殖過程中起著重要調(diào)控作用。推測腺苷可能通過激活Wnt 信號通路從而促進(jìn)內(nèi)源性NSCs 增殖。

腺苷通過Wnt 信號途徑對神經(jīng)系統(tǒng)的NSCs 增殖有著重要的作用，但是其對NSCs 的分化作用會是怎樣呢，仍需做進(jìn)一步研究。如果能夠深入明確腺苷對NSCs 增殖分化的作用機(jī)制，并以此為依據(jù)，為科研和臨床提供不同目的的NSCs，對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療將會有很大的意義。

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