江 芮，呂 浩，李 申，王麗莉

隨著老齡化的發(fā)展，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)已成為繼心腦血管、腫瘤之后又一危害老年人健康的疾病，表現(xiàn)為退行性的神經(jīng)系統(tǒng)病變［1］。在AD 眾多的發(fā)病機制假說中，氧化應(yīng)激假說越來越引起關(guān)注［2］。PC12 細胞株源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，它在形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能上與神經(jīng)細胞有許多相似之處，被廣泛用于神經(jīng)藥理學(xué)方面的研究［3］，H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞損傷是經(jīng)典的細胞氧化損傷模型，由活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)退行性疾病中起了至關(guān)重要的作用［4］，H2O2是體內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種ROS，可以透過細胞膜，能夠與多種生物靶標(biāo)分子反應(yīng)。

近年來，從天然產(chǎn)物中尋找具有清除自由基活性的物質(zhì)用于保護細胞免受氧化損傷備受關(guān)注。黃酮類化合物可以對神經(jīng)元發(fā)揮類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護作用［5］。槲皮苷(Quercitrin)是一種廣泛存在于中草藥和蔬果中的天然黃酮類化合物，研究證明其具有抗氧化、抗癌、抗病毒等作用［6］。本研究利用H2O2誘導(dǎo)類神經(jīng)細胞系PC12 凋亡建立模型，檢測槲皮苷對PC12 細胞的保護作用并初步分析其作用機制，為其在神經(jīng)退行性疾病治療上提供可行性的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 槲皮苷購于阿拉丁試劑有限公司，純度≥98%，DMSO 購于上海生物工程有限公司，DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco 公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司，MTT、DAPI購于Sigma 公司，H2O2(30%，AR 級)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。乳酸脫氫酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Cytc 和caspase-3 一抗、HRP 標(biāo)記二抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12 細胞)購于中國科學(xué)院上海細胞所。

1.2 儀器 倒置顯微鏡(OLYMPUS);多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國);美國UVP 凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國);熒光顯微鏡TE2000-U(Nikon，日本)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 用含10% 小牛血清的DMEM 細胞培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)PC12 細胞，每隔48 h 換液。用0.25%胰蛋白酶進行消化。

1.3.2 H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞損傷模型的建立PC12 細胞消化、計數(shù)，以8×104個/ml (100 μl)細胞接種于96 孔板中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基將H2O2分別配成0、100、200、400、800、1600 μmol/L 各濃度，分別加入96 孔板中，每孔100 μl，每組6 個復(fù)孔，分別作用2、4、6 h 后，棄掉上清，用PBS 洗滌3 次，每次200 μl。分別加入MTT(5 mg/ml)工作液100 μl，繼續(xù)孵育4 h 后加入100 μl DMSO，微孔振蕩器上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm 下的吸光度值。

1.3.3 槲皮苷給藥劑量篩選 槲皮苷用DMSO 溶解，配成終濃度為1600 mmol/L 的母液。為了檢測槲皮苷對PC12 細胞的影響，收集對數(shù)生長期的PC12 細胞，將濃度為8 ×104個/ml (100 μl)細胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，給予不同終濃度的槲皮苷(0、50、100、200、400、800、1600 μmol/L)分別預(yù)處理12 h 后，MTT 法檢測細胞的生長存活率。

1.3.4 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞活力的影響 為了檢測槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞保護作用，實驗方法分為5 組，空白對照組(Control):每孔加入100 μl 無血清培養(yǎng)液;模型組(Model):加入100 μl、400 μmol/L H2O2作用4 h;槲皮苷(Quercitrin)保護組:先用不同終濃度的槲皮苷100、200、400 μmol/L 分別預(yù)處理12 h 后，吸出藥物，然后加入100 μl、400 μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，MTT法檢測細胞的生長存活率。

1.3.5 LDH 釋放量的檢測 將PC12 細胞以2×105cells/well (2 ml)的密度接種于6 孔板，孵育培養(yǎng)24 h 后，按照參考文獻［7］的方法，背景空白對照孔為無細胞的培養(yǎng)液，按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，取各孔上清120 μl 于新的96 孔板中，再加入60 μl LDH 檢測工作液，避光室溫孵育30 min后，在490 nm 處測量吸光度值。

1.3.6 DAPI 熒光核染色分析 將PC12 細胞以2×105cells/well (2 ml)的密度接種于6 孔板，孵育培養(yǎng)24 h 后，按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，用PBS 清洗3 遍后，加入1 μg/ml 的DAPI 溶液，37 ℃孵育5 min，PBS 清洗后用熒光顯微鏡進行拍照觀察。

1.3.7 Western blotting 法檢測蛋白表達水平按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，0.25%胰酶消化，離心收集細胞500 g 離心10 min，以PBS 洗兩次，細胞總蛋白提取用PIPA 細胞裂解液置冰浴裂解，14 000 × g 離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA 法進行蛋白定量后，取等量樣品以12% SDS-PAGE 進行電泳。胞漿蛋白提取用胞漿蛋白提取試劑盒進行，細胞加入適量緩沖液A，渦旋震蕩15 s，放置上10 min，加入總體積的1/20 體積的緩沖液B，快速震蕩混勻，放置冰上1 min 后，16，000 g，4 ℃，離心30 s，收集上清至新的離心管中，即為胞漿蛋白。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，用Cytc、casepase-3 抗體(濃度1∶ 100)孵育過夜，再以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL 顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的積分灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞損傷模型的建立MTT 實驗結(jié)果顯示，細胞抑制率隨H2O2的濃度的升高和作用時間的延長而增加，當(dāng)400 μmol/L H2O2作用4 h 時，其細胞抑制率達到50.8% (P ＜0.01)左右，作為最佳造模條件。

2.2 槲皮苷單獨給藥對PC12 細胞的影響藥物劑量在400 μmol/L 以下的藥物處理組與對照組相比差異沒有顯著性(P ＞0.05)，表明對細胞沒有損傷作用;而當(dāng)藥物劑量大于800 μmol/L 時，藥物處理組與對照組相比差異具有顯著性(P ＜0.01)，表明此時的藥物濃度對細胞有損傷作用。因此，選擇100、200、400 μmol/L 作為合適的給藥濃度。

2.3 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞活力的影響 槲皮苷預(yù)孵育12 h 后，加入400 μmol/L H2O2作用4 h，細胞活力檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細胞活力明顯降低(P ＜0.01);與模型組相比，槲皮苷保護組細胞活力明顯提高(P ＜0.01)，且呈劑量依賴性(見圖1)。

2.4 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞LDH 釋放量的影響 實驗以LDH 釋放量作為PC12 細胞損傷程度檢測指標(biāo)，與正常組比較，H2O2誘導(dǎo)后PC12的LDH 釋放量明顯升高(P ＜0.01)，而預(yù)防應(yīng)用槲皮苷能夠顯著降低LDH 釋放量(P ＜0.01)(見圖2)。

2.5 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 空白對照組細胞的細胞核呈均勻的淡藍色，模型組細胞呈現(xiàn)強烈的藍色熒光，提示細胞的細胞核固縮或碎裂。而400 μmol/L槲皮苷預(yù)處理組細胞藍色熒光明顯弱于模型組。

2.6 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞中相關(guān)凋亡蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細胞胞漿中Cytc 和細胞內(nèi)caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P ＜0.01);與模型組相比，槲皮苷預(yù)孵育組(100、200、400 μmol/L)細胞胞漿中Cytc 和細胞內(nèi)caspase-3 蛋白表達水平均有不同程度的降低，且具有劑量依賴性(見圖3)。

圖1 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞保護作用

圖2 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞LDH 釋放量的影響

圖3 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞中相關(guān)凋亡蛋白表達的影響

3 討論

本研究為了探討槲皮苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷的保護作用和機制，首先采用MTT 法對H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷濃度和時間進行檢測。實驗結(jié)果表明400 μmol/L H2O2作用細胞4 h 后，細胞活力抑制率為50.8%，該濃度下細胞有一定比例凋亡，但又不至于大量死亡，所以本研究選用400 μmol/L H2O2造模。MTT 法確定了3 個無毒劑量:100、200、400 μmol/L后對槲皮苷進行保護作用和機制的研究。

LDH 是細胞內(nèi)標(biāo)志酶，受損的細胞膜通透性發(fā)生改變，LDH 漏出量明顯增大，其累計釋放量與細胞受損的程度呈正相關(guān)［8］，細胞損傷時LDH 會釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中LDH 的濃度可反映出細胞的損傷程度，與正常對照組相比，H2O2能造成培養(yǎng)液中LDH 顯著提高，100～400 μmol/L 槲皮苷能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的LDH 的釋放。

DAPI 熒光核染色結(jié)果表明槲皮苷能夠減輕由H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞凋亡。細胞內(nèi)線粒體的雙層膜受到破壞后會形成穿膜孔道，通透性增加，促進Cytc 的釋放，胞漿中Cytc 含量也是指示細胞凋亡的重要指標(biāo)［9］。實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2可導(dǎo)致PC12 細胞細胞胞漿中Cytc 和細胞內(nèi)caspase-3 蛋白表達升高。提示H2O2可通過線粒體細胞色素C 介導(dǎo)的凋亡通路，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。caspase-3 的活化是凋亡進入不可逆階段的標(biāo)志，槲皮苷預(yù)孵育后可下調(diào)胞漿中Cytc 和細胞內(nèi)caspase-3 蛋白表達，進而產(chǎn)生抗凋亡的作用。

綜上所述，槲皮苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷具有一定的保護作用，可以提高H2O2損傷人PC12 細胞的存活率，降低LDH 釋放量，下調(diào)胞漿中Cytc 和細胞內(nèi)caspase-3 蛋白表達。提示槲皮苷可保護和修復(fù)過氧化H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞的損傷，其機制可能與抑制細胞凋亡線粒體途徑中凋亡相關(guān)蛋白Cytc 和caspase-3 的表達有關(guān)。

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