陳小波，占樂云，王 強(qiáng)，舒愛華，張明瑜，鄧彩英

神經(jīng)科學(xué)的研究表明，神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共同組成了一個(gè)完整的神經(jīng)功能單元，它們之間相互的信號(hào)聯(lián)系與血腦屏障功能的完整密切相關(guān)［1，2］。研究證實(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞等以旁分泌作用的方式分泌血管生成素1(Ang1)，并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Tie2 受體、調(diào)控其下游的抗凋亡等信號(hào)通路［3］。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，DHA預(yù)處理能夠明顯上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪環(huán)境下Ang1 的分泌。由于DHA 能夠經(jīng)多靶調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)作用，因此初步推測(cè)DHA 可能通過上調(diào)缺血環(huán)境下膠質(zhì)細(xì)胞Ang1 的分泌水平，產(chǎn)生對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并維持血腦屏障的完整性。我們希望為進(jìn)一步探討DHA 的腦保護(hù)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 Nu47-E 可調(diào)氧濃度孵箱(Nuaire，美國)、流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)、TCSSP5 激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)。兔抗大鼠vWF 多克隆抗體(Chemicon，美國);Bax、bcl-2(cell signaling);capase-3 (Santa Cruz 公司);ZO-1、HRP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗、HRP 標(biāo)記兔抗羊二抗(武漢博士德生物工程有限司);P-tie2(MILYPORE);顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物)。

1.2 腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和BMECs 的分離與培養(yǎng)取2～3 w SD 大鼠，雌雄均可，體重40～60 g (華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，按照文獻(xiàn)中描述的方法分別分離、培養(yǎng)和純化腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和BMVECs。第3 代細(xì)胞95%以上為BMECs，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 氧糖剝奪模型(OGD)的建立 將原代培養(yǎng)的兩種細(xì)胞在5% CO2條件下培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞同步化。然后用無糖、無血清的DMEM 液置換原培液，再經(jīng)94% N2∶ 5% CO2∶ 1% O2低氧條件下培養(yǎng)24 h。

1.4 腦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液 腦膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Ⅰ)、OGD 組(Ⅱ)、10 μmol DHA 預(yù)處理組(Ⅲ)、40 μmol DHA 預(yù)處理組(Ⅳ)。在正常對(duì)照組加入含血清和葡萄糖的DMEM，OGD 組和DHA 預(yù)處理組為無糖、無血清的DMEM。DHA 組另加入兩種濃度的DHA 后在5%CO2和95%空氣條件預(yù)處理培養(yǎng)1 h。除正常對(duì)照組在5% CO2和95%空氣條件下培養(yǎng)外，其余組94% N2∶ 5%CO2∶ 1% O2條件下培養(yǎng)，所有組培養(yǎng)時(shí)間為24 h。收集各組培養(yǎng)后的上清液。

1.5 BMECs 和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液共培養(yǎng) 將血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照+培養(yǎng)上清液Ⅰ(A 組)、OGD+培養(yǎng)上清液Ⅱ(B 組)、OGD+培養(yǎng)上清液Ⅲ(C 組)、OGD +培養(yǎng)上清液Ⅳ(D 組)、OGD+sTie2Fc+培養(yǎng)上清液Ⅲ(E 組)、OGD+sTie2Fc+培養(yǎng)上清液Ⅳ(F 組)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。各組先培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞同步化。然后置換原培養(yǎng)液:在A 組加入2/3 量的含血清、和葡萄糖DMEM 和1/3 量的培養(yǎng)上清液Ⅰ;B 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養(yǎng)上清液Ⅱ;C 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3量的培養(yǎng)上清液Ⅲ;D 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養(yǎng)上清液Ⅳ;E 組加入2/3量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養(yǎng)上清液Ⅲ及10 μg/ml sTie2Fc;F 組組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養(yǎng)上清液Ⅳ及10 μg/ml sTie2Fc。除正常對(duì)照組在5%CO2和95%空氣條件下培養(yǎng)外，其余組94%N2∶ 5%CO2∶ 1%O2培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 用不含EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1500 rpm，5 min 離心，去上清，加PBS 重懸;用PBS 將細(xì)胞潤(rùn)洗兩次，1500 rpm，5 min，按照AnnexinV＆PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行:各樣品分別加入500 μl Binding Buffer，5 μl AnnexinV，5 μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min(同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，即正常細(xì)胞不加AnnexinV 和PI;陽性對(duì)照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對(duì)照，只加5 μl AnnexinV 單標(biāo);陽性對(duì)照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對(duì)照，只加5 μl PI 單標(biāo))流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 Western blotting 法 檢 測(cè) Bax、bcl-2、caspase-3 等總蛋白 取適量RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)蛋白濃度后，各樣品取50 μg 總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制8%的PAGE 膠電泳。根據(jù)預(yù)染Marker 顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。取出凝膠根據(jù)Marker 切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE 凝膠相同大小的PVDF 膜和濾紙，PVDF 膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF 膜，室溫?fù)u床封閉2 h。TBST 充分洗滌PVDF 膜5～6 次，5 min/次。用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP 標(biāo)記二抗-1 ∶ 50000 稀釋，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。TBST 充分洗滌PVDF 膜5～6 次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL 底物液，孵育數(shù)分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X 光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Band Scan 分析膠片目的蛋白和內(nèi)參照條帶的灰度值，將目的條帶的灰度值與同一樣本內(nèi)參照的灰度值相比，得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后的上清液Ang1 含量 與正常對(duì)照組比較(1279.33 ±16.27)pg/ml，OGD 組Ang1 分泌量明顯降低(1073.67 ±24.55)pg/ml (P ＜0.01)，OGD+40 μmol DHA 組有明顯增加(1758.01 ±33.18)pg/ml (P ＜0.01)，但OGD +10 μmol DHA 組Ang1 分泌量無差異(1363.33.01 ±28.94)pg/ml P ＞0.05);與OGD 組比較，OGD +10 μmol DHA 組 和OGD+40 μmol DHA 組Ang1 分泌量均明顯增加(P ＜0.01);與OGD +10 μmol DHA組比較，OGD +40 μ mol DHA 組有明顯差異(P ＜0.01)。

2.2 腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與A 組比較，其余各組腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均明顯增加(P ＜0.01);與B 組比較，C 和D 兩組細(xì)胞凋亡明顯降低(P ＞0.01)，與B 組比較，E 組和F 組細(xì)胞凋亡也有明顯差異(P ＜0.01);但與C 組比較，E 組細(xì)胞凋亡明顯增加(P ＜0.01);與D 組比較，F(xiàn) 組細(xì)胞凋亡明顯增加(P ＞0.01)(見圖1)。

2.3 Bax、bcl-2、caspase-3 等蛋白表達(dá) Western blotting 結(jié)果顯示，各組之間內(nèi)參蛋白β-actin 表達(dá)無差異(P ＞0.05);與A 組比較，其余各組Bax、caspase-3 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達(dá)明顯降低(P ＜0.01);與B 組比較，C 和D 兩組細(xì)胞Bax、caspase-3 表達(dá)明顯降低(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01);與B 組比較，E 組和F 組Bax、caspase-3 有明顯降低(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01);與C 組比較，E 組細(xì)胞Bax、caspase-3 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達(dá)明顯降低(P ＜0.01);與D 組比較，F(xiàn) 組細(xì)胞組Bax、caspase-3、bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達(dá)均有明顯降低(P ＜0.01)(見表1、表2)。

2.4 Western blotting 化學(xué)發(fā)光免疫印跡圖各組Bax、bcl-2、caspase-3 和β-actin 等蛋白Western blotting 化學(xué)發(fā)光免疫印跡圖(見圖2)。

表1 Western blotting 檢測(cè)caspase-3、bax、bcl-2、bcl-2/bax 的表達(dá)(n=3，)

表1 Western blotting 檢測(cè)caspase-3、bax、bcl-2、bcl-2/bax 的表達(dá)(n=3，)

與A 組比較* P ＜0.01;與B 組比較#P ＜0.01;與C 組比較△P ＜0.01;與D 組比較▽P ＜0.01

表2 Western blotting 檢測(cè)p-tie2、P-Akt-2、ZO-1的表達(dá)(n=3，)

表2 Western blotting 檢測(cè)p-tie2、P-Akt-2、ZO-1的表達(dá)(n=3，)

與A 組比較* P ＜0.01;與B 組比較#P ＜0.01;與C 組比較△P＜0.01;與D 組比較▽P ＜0.01

圖1 腦血管膠質(zhì)細(xì)胞凋亡流式分析結(jié)果

圖2 A 組:正常對(duì)照+培養(yǎng)上清液Ⅰ;B 組:OGD+培養(yǎng)上清液Ⅱ;C 組:OGD+培養(yǎng)上清液Ⅲ;D 組:OGD+培養(yǎng)上清液Ⅳ;E 組:OGD+培養(yǎng)上清液Ⅲ+sTie2Fc;F 組:OGD+培養(yǎng)上清液Ⅳ+sTie2Fc

3 討論

我們的研究結(jié)論表明:經(jīng)DHA 預(yù)處理后的膠質(zhì)細(xì)胞，并在體外模擬缺血/缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，其上清液中Ang1 的含量明顯增加。當(dāng)將其上清液加入到同樣缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中，后者的凋亡出現(xiàn)明顯降低。已有其它研究證實(shí)，低氧條件下培養(yǎng)的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GDNF 與TGF-β1［4］，對(duì)同樣缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的腦神經(jīng)元細(xì)胞等產(chǎn)生保護(hù)作用，但是Ang1 并不參與這種保護(hù)作用機(jī)制［5］。其原因可能是在低氧環(huán)境下星形膠質(zhì)細(xì)胞Ang1 mRNA 和Ang1 分泌水平發(fā)生明顯下降［6］。在本實(shí)驗(yàn)中也同樣發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)DHA 預(yù)處理的膠質(zhì)細(xì)胞Ang1 分泌水平與正常氧含量條件下比較有明顯降低。Ang1 是Tie-2 的配體，Tie-2 激活后經(jīng)PI3/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用［7］。表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax 等水平下降，而抗凋亡蛋白bcl-2 生成增加［8］。在研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DHA 預(yù)處理的膠質(zhì)細(xì)胞在低氧環(huán)境下培養(yǎng)上清液，使血管內(nèi)皮細(xì)胞Tie-2 受體的磷酸化水平及其下有信號(hào)通路PI3/Akt 激活水平明顯增加。當(dāng)加入抑制劑(sTie2Fc)后，細(xì)胞凋亡和Bax 水平明顯增加，而抗凋亡蛋白bcl-2 生成明顯降低。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，其保護(hù)機(jī)制可能與Ang1 激活Tie-2 明顯相關(guān)。

研究結(jié)果還表明:經(jīng)DHA 預(yù)處理的膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)后的上清液，能夠使血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1 蛋白表達(dá)增加。ZO-1 蛋白對(duì)于維持血腦屏障的完整性具有重要的作用［9，10］。當(dāng)加入抑制劑后，與相應(yīng)未加抑制劑組比較，ZO-1 蛋白的表達(dá)明顯下降。但研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，加入抑制劑并不能完全消除使ZO-1 蛋白的表達(dá)上調(diào)的作用，這些研究說明上調(diào)ZO-1 蛋白表達(dá)的機(jī)制，可能大部分作用與Ang1激活Tie-2 受體相關(guān)，同時(shí)也可能還有其它作用機(jī)制參與。

綜上所述，DHA 預(yù)處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠增強(qiáng)對(duì)氧糖剝奪環(huán)境下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Ang1 的表達(dá)，激活Tie-2受體后，經(jīng)PI3/Akt 等下游信號(hào)通路作用相關(guān)。

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