董 梅，王 彬，辛立建，郭 力，檀國軍，劉瑞春

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，發(fā)病機制尚不完全清楚，考慮與遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)，目前越來越多研究表明MS 發(fā)病可能與患者體內(nèi)Th17/Treg 細胞失衡有關(guān)。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認的MS 經(jīng)典模型，對MS 的發(fā)病機制、病程進展、診治方法等研究有重要的指導(dǎo)作用。近來研究發(fā)現(xiàn)MS/EAE 或許與Th17/Treg 失衡有關(guān)。

JAK-STAT 信號通路廣泛參與炎癥反應(yīng)、腫瘤等多種生理、病理反應(yīng)。JAK 是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)JAK 家族包括JAK1-3 及TYK2。STAT 即信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，磷酸化后進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄。不同細胞因子激活不同的JAK 引起相應(yīng)的STAT 磷酸化，從而調(diào)節(jié)特定基因?qū)?yīng)產(chǎn)物的含量引起各種生物效應(yīng)。JAK-STAT 信號通路同時參與了Th17 和Treg細胞分化的調(diào)節(jié)。

本研究應(yīng)用JAK2 特異性抑制劑AG490 干預(yù)C57BL/6 小鼠EAE 模型，觀察EAE 小鼠脊髓組織病理變化及免疫組化染色IL-17、Foxp3+及p-STAT5表達情況。探討JAK2 抑制劑通過調(diào)控JAK-STAT信號通路，對Th17/Treg 平衡的影響和對EAE/MS的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

1.1.1 試 劑 MOG35-55 多肽購自西安霖肽生物科技有限公司，百日咳毒素購自ENZO 公司，AG490 購自Selleck 公司，F(xiàn)oxP3 抗體購自Immuno-Way 公司，p-STAT5 抗體購自bioworld 公司，IL-17抗體購自博士德公司。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6 小鼠60 只，體重18～22 g，6～8 周齡，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號SCXK 冀2008-1-003)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將實驗動物隨機分為對照組、EAE 組和AG490 組。每組按時間點分為免疫后13 d 即發(fā)病初期組，免疫后20 d 即高峰期組，每個時間點動物各10 只。

1.2.2 動物模型建立與干預(yù) 以200 μl 磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解300 μg 人工合成MOG35-55 多肽，與等量含有4 mg/ml 卡介苗的完全弗氏佐劑(CFA)充分混合成為油包水乳劑，制備完全抗原，免疫小鼠。EAE 組和AG490 組均于免疫后第0 小時和48 h 于腹腔內(nèi)注射百日咳毒素500 ng，制備EAE模型。直接將200 μl PBS 與等量CFA 乳化免疫動物作為對照組。干預(yù)時，于免疫后第3、5、7、9、11、13、15、17、19 天給予AG490 組小鼠AG490 1 mg 皮下注射至處死，生理鹽水0.1 ml/d 給予對照組和EAE 組小鼠皮下注射。免疫當天記為第0 天。

1.2.3 指標觀察 按實驗設(shè)計，各組動物于免疫后第13 天和第20 天取材，以水合氯醛麻醉小鼠至出現(xiàn)軟癱狀態(tài)，用生理鹽水沖洗左心室，之后用4%多聚甲醛灌注，取材后將脊髓組織固定于4%多聚甲醛，制備蠟塊，進行HE 染色及免疫組化染色，觀察炎癥、IL-17、Foxp3+及p-STAT5 表達情況。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性(P ＜0.05)則進行秩轉(zhuǎn)換，多組計量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOVA 方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法，P ＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 小鼠免疫后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、體重減輕，于免疫后12 d 開始出現(xiàn)尾部無力、肢體癱瘓和二便失禁等，AG490 組較EAE組小鼠發(fā)病率下降，發(fā)病時間延遲，癥狀減輕。

2.2 小鼠脊髓HE 染色 EAE 組小鼠發(fā)病初期可見少量“血管袖套”現(xiàn)象和大量淋巴細胞浸潤，發(fā)病高峰期可見到較多的“血管袖套”現(xiàn)象和更多的淋巴細胞浸潤，而AG490 組同時期炎癥均較EAE組減輕(見圖1)。

2.3 小鼠脊髓IL-17、Foxp3+及p-STAT5 表達情況 EAE 組小鼠脊髓發(fā)病高峰期較發(fā)病初期IL-17 陽性細胞數(shù)量增多(P ＜0.05)，p-STAT5 和Foxp3陽性細胞數(shù)目減少(P ＜0.05)。AG490 組小鼠脊髓IL-17 陽性細胞數(shù)目較同時期EAE 組小鼠減少(P ＜0.05)，p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數(shù)目增多(P ＜0.05，見表1～表3)。

表1 各組IL-17 陽性細胞數(shù)目比較()

表1 各組IL-17 陽性細胞數(shù)目比較()

高峰期與發(fā)病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

表2 各組Foxp3 陽性細胞數(shù)目比較()

表2 各組Foxp3 陽性細胞數(shù)目比較()

高峰期與發(fā)病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

表3 各組p-STAT5 陽性細胞數(shù)目比較()

表3 各組p-STAT5 陽性細胞數(shù)目比較()

高峰期與發(fā)病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

3 討論

Th17 細胞與包括MS、SLE、RA 在內(nèi)的多種自身免疫性疾病有密切聯(lián)系。在MS 中Th17 細胞通過自身表達的趨化因子受體CCR6 與脈絡(luò)叢上皮細胞的趨化因子受體配體CCL20 相互作用從而透過脈絡(luò)叢進入蛛網(wǎng)膜下腔，進一步引起其他炎癥細胞聚集，釋放IL-17 在內(nèi)的細胞因子從而引起相應(yīng)炎癥介質(zhì)釋放造成BBB 破壞、髓鞘脫失、軸索損傷等病理損害［1］。Th17 細胞是由初始CD4+T 細胞在IL-6和TGF-β 的共同作用下分化而來［2］，如果只存在TGF-β 而缺失IL-6，初始CD4+T 細胞則分化為Treg細胞［3］。維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt(RORγt)以及RORα 屬于細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子核受體家族中的成員，他們是Th17 重要的轉(zhuǎn)錄因子。由IL-6 在TGF-β 存在的前提下，通過IL-6R 募集并磷酸化JAK1、JAK2、Tyk2，磷酸化后的JAK2 把結(jié)合在IL-6R 上的STAT3磷酸化形成二聚體，進入細胞核調(diào)節(jié)靶基因上調(diào)RORγt，促進Th17 細胞形成以及IL-17 分泌。IL-17可以通過加強粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)和GM-CSF 受體增加嗜中性粒細胞、巨噬細胞等聚集。IL-17 還可以激活NF-κB、MAPK 信號通路加強促炎癥因子CXCL1、CXCL2、CXCL5 等合成［4］。此外IL-17 還能促進基質(zhì)金屬蛋白(MMPs)的合成以幫助T 細胞降解胞外基質(zhì)。

Treg 細胞是一類高表達IL-2 受體α 鏈(CD25)的CD4+T 細胞，在免疫應(yīng)答的負調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮重要保護作用，此類細胞功能障礙可導(dǎo)致自MS 在內(nèi)的多種自身免疫性疾病、代謝性疾病、過敏性疾病等異常。叉頭蛋白3(Foxp3)不僅是Treg細胞重要的標志，同時也參與Treg 的分化及功能。Foxp3 的功能缺失可以導(dǎo)致X 連鎖隱性自身免疫和炎性綜合征［5］。Treg 細胞主要包括從胸腺直接分化而來的自然調(diào)節(jié)T 細胞(nTreg)和在外周由初始CD4+T 細胞接受抗原及其他因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)T 細胞(iTreg)。它們的表型都是CD4+CD25+Foxp3+Treg，主要通過與靶細胞直接接觸及分泌TGF-β、IL-10、IL-35 細胞因子來抑制免疫應(yīng)答。Treg 細胞主要通過細胞毒T 淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4/CD152)影響CD80/CD86 介導(dǎo)的效應(yīng)T 細胞及APC 與靶細胞接觸的抑制自身攻擊細胞［6］，而TGF-β、IL-10 主要通過抑制DC 來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［5］。并且TGF-β 通過Smad 家族同時參與了Th17 和Treg 細胞分化調(diào)節(jié)。

JAK-STAT 信號通路廣泛參與CD4+T 細胞的分化，初始CD4+T 細胞在IFN-γ 和IL-12 作用下通過JAK1/JAK2-STAT1/STAT4 調(diào)控Th1 細胞分化，在IL-4 作用下通過STAT4/GATA3 調(diào)控Th2 細胞分化，在TGF-β 和IL-6 作用下通過JAK2/JAK1/Tyk2-STAT3 調(diào)控Th17 細胞分化，在TGF-β 和IL-2 作用下通過JAK1/JAK3-STAT5 調(diào)控Treg 細胞分化。AG490 是JAK2 特異性酪氨酸激酶抑制劑，并且不影響JAK1、Tyk2 的活性，被廣泛用于抑制JAK2 參與的 信 號 傳 導(dǎo)［7，8］，所 以AG490 主 要 通 過 抑 制JAK2-STAT3 信號通路影響Th17 細胞的分化和IL-17 的合成，由于調(diào)節(jié)Treg 細胞分化功能的主要是JAK1/JAK3-STAT5 信號通路以及Smad 蛋白家族，所以AG490 并不影響CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞分化和功能，故本實驗應(yīng)用AG490 腹腔注射于小鼠EAE 模型來觀察小鼠炎癥反應(yīng)情況及JAK2 抑制劑對Th17/Treg 細胞平衡的影響情況。

由于STAT3 不僅對Th17 分化起重要作用，同時也參與Treg 分化的調(diào)節(jié)［9］，而IL-17 和EAE 的進展具有直接關(guān)系，所以，我們將IL-17 作為Th17 數(shù)量和功能的觀察指標?？梢钥吹诫S著小鼠EAE 模型發(fā)病，EAE 組小鼠逐漸表現(xiàn)出食欲減低、精神萎靡、尾部無力等臨床癥狀，并且HE 染色可以觀察到小鼠脊髓組織內(nèi)淋巴細胞浸潤增多，“血管袖套”現(xiàn)象逐漸明顯，而此時IHC 觀察到小鼠脊髓內(nèi)IL-17陽性細胞數(shù)增多，說明逐漸增多的Th17 細胞和IL-17 導(dǎo)致小鼠病情的進展，在AG490 組小鼠中也可以看到隨著時間推移，IL-17 陽性細胞數(shù)目的增多，但在與EAE 組相對應(yīng)時期的小鼠相比IL-17 陽性細胞數(shù)目相比較少，這也與AG490 組小鼠臨床癥狀相對較輕符合，這說明AG490 抑制了Th17 細胞的分化和功能。

Th17 細胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞分化和功能在多個水平上相互抑制拮抗，Smad7 對Foxp3表達具有抑制作用，IL-6R 可以通過增加Smad7 的表達來抑制TGF-β 引起的Foxp3 表達［10］，此外ROR-γt 和Foxp3 也具有互相抑制作用［11］，STAT3和STAT5 由于都具有SH2 結(jié)構(gòu)域也可以相互競爭結(jié)合位點，所以Th17 在許多層面上都對Treg 具有抑制作用，這或許可以解釋為什么當TGF-β 單獨存在是初始CD4+T 細胞向Treg 方向分化，而當TGFβ 和IL-6 同時存在時則初始CD4+T 細胞向Th17 方向分化。故當我們用JAK2 抑制劑AG490 抑制IL-6-JAK2-STAT3 的信號傳導(dǎo)后不僅可以抑制Th17 細胞分化和IL-17 合成，而且通過減小Th17 對Treg 的抑制可以促進CD4+CD25+Foxp3+Treg 分化。由于CD4+CD25+Foxp3+Treg 不僅釋放抗炎介質(zhì)而且還能與炎癥細胞相互接觸來發(fā)揮抗炎作用，TGF-β 不僅促進CD4+CD25+Foxp3+Treg 分化，也對通過Smad 蛋白對Th17 細胞分化起重要作用，IL-10 則不僅具有抗炎作用也可以發(fā)揮促進炎癥反應(yīng)的作用［12］，但基本nTreg 和iTreg 都表達Foxp3，并且Foxp3 也對CD4+CD25+Foxp3+Treg 的功能發(fā)揮起作用，所以我們將p-STAT5 和Foxp3 作為衡量CD4+CD25+Foxp3+Treg 數(shù)量和功能的指標?？梢钥吹讲徽揈AE 組還是AG490 組發(fā)病高峰期與發(fā)病初期相比，高峰期p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數(shù)量都有一定程度減少，這說明隨著EAE 病情發(fā)展，Th17 逐漸增多對CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的抑制作用也逐漸加強，Th17/Treg 平衡偏向Th17 細胞導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加強。但同一時期AG490 組小鼠脊髓p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數(shù)比EAE 組小鼠脊髓明顯增多，這與AG490 組小鼠炎癥細胞浸潤相對較少及“血管袖套”現(xiàn)象不如EAE 組小鼠明顯相一致，說明AG490 雖然沒有完全阻止EAE 發(fā)病，但很大程度上抑制了Th17 細胞的功能促使Th17/Treg平衡偏向Treg 方向，并減緩EAE 小鼠炎癥反應(yīng)。

總之，AG490 作為一種JAK2 特異性抑制劑緩解了EAE 小鼠的炎癥反應(yīng)，調(diào)整Th17/Treg 的方向，顯示出了對MS 患者的潛在治療價值，并且SOCS1 和SOCS3 具有相似的作用，都可以與通過抑制JAK2 磷酸化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［13］，同時由于Treg 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與MS 在內(nèi)的多種自身免疫性疾病，預(yù)示著與通過干預(yù)JAK2-STAT3-SOCS 信號通路來調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡或許可以成為MS 等自身免疫性疾病一個新的治療方向。

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圖1 各組小鼠不同發(fā)病時期脊髓HE 染色(HE，×400)