宋海慶，李 寧，張安波，任長虹

腦血管病以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率及逐年遞增的防治費用成為危害人民健康最為嚴重的疾病之一，目前急性期最有效的臨床治療為動、靜脈溶栓，通過及時實現(xiàn)缺血區(qū)域的血液再灌注，可能從根本上阻止神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷。但其嚴格的時間窗和出血風(fēng)險導(dǎo)致僅有不到3%的患者接受溶栓治療［1］。作為一種機體內(nèi)源性對抗缺血損傷的保護策略，缺血適應(yīng)為缺血性腦血管病的治療提供了一條新的思路［2］。遠隔缺血期適應(yīng)(remote ischemic perconditioning)是指在缺血敏感的重要靶器官發(fā)生缺血事件后，通過對相對耐受缺血的遠隔器官給予多次短暫的缺血/再灌注處理產(chǎn)生的保護作用。2014 年來自丹麥的研究小組進行了隨機對照臨床實驗［3］，在患者出現(xiàn)腦卒中后，在送往醫(yī)院的救護車上給患者實施肢體缺血遠隔適應(yīng)(limb remote ischemic conditioning，LRIC)。研究結(jié)果顯示，與對照組比較，肢體缺血適應(yīng)能夠降低腦組織梗死的風(fēng)險。近年LRIC 對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用已得到共識，然而目前，對于肢體缺血適應(yīng)降低腦水腫的作用及其機制尚不十分清楚。而缺血后持續(xù)的腦水腫是導(dǎo)致死亡率增加的重要因素之一。腦缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生主要為血腦屏障(BBB)破壞導(dǎo)致的血管源性水腫(vasogenic edema)、細胞毒性水腫(cytotoxic edema)以及滲透性水腫(osmotic edema)［4］。MMP-9 參與了腦缺血急性期血-腦屏障的破壞，導(dǎo)致血管源性腦水腫和腦出血［5］，TIMP-1 能夠抑制MMP-9 的表達［6］。水通道蛋白Aquaporins(AQP)為跨膜分布的四聚體蛋白，調(diào)控細胞內(nèi)外水分子的轉(zhuǎn)運，參與腦缺血后血管源性及細胞毒性水腫。13 個家族成員中AQP-4 與AQP-9 與缺血后腦水腫密切相關(guān)。本研究利用大鼠MCAO 模型，探討LRIC 對缺血/再灌注后腦水腫的影響，同時探討LRIC 對MMP-9 及水通道蛋白AQP-4、AQP-9 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試藥及實驗器材 恩氟烷(河北九派制藥)，水合氯醛(化學(xué)純，北京化工廠)，TTC (Sigma公司)，伊文思藍(Evans Blue，EB)(Sigma 公司)，甲酰胺分析純(天津市德蘭精細化工廠，分析純)，BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo 公司)，抗MMP-9 抗體(Santa Cruze 公司)，抗AQP-9、AQP-4 抗體(Santa Cruze 公司)，HRP 標記的二抗(中杉金橋公司)。

1.2 實驗動物與分組 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(280-300 g)，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，SCXK(京)2007-0001。將動物隨機分為3 組:大腦中動脈結(jié)扎(middle cerebral artery occlusion，MCAO)(對照組)、MCAO+LRIC (治療組)及假手術(shù)組(Sham)。

1.3 局灶腦缺血/再灌注MCAO 模型 大鼠1%～2%恩氟烷混合30% O2和70%N2O 維持麻醉，大鼠右側(cè)MCAO 模型采用Zea longa 線栓法制備，術(shù)中肛溫維持在(37 ±2)℃。小心分離右側(cè)頸總動脈，將線拴由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，沿頸內(nèi)動脈向斜上方將線栓插入至有抵觸感時停止插栓。栓塞1.5 h 后拔除線栓制備缺血/再灌注損傷模型。模型制作后隨機分為對照組與治療組。缺血10 min 后給予肢體缺血適應(yīng)(8 mm 寬止血帶扎緊大鼠栓側(cè)下肢近心端，10 min 缺血，再灌注10 min，共3 個循環(huán))。再灌注48 h 后取材進行后續(xù)研究。

1.4 血腦屏障通透性測定 大鼠再灌注后46 h經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(2%，4 ml/kg)，使其在體內(nèi)循環(huán)2 h 后麻醉，經(jīng)左心室進針插入到主動脈弓灌注生理鹽水200～250 ml，分別取大腦左右半球稱重，加入2 ml 甲酰胺勻漿，54 ℃溫育2 h 后離心(12，000 g，15 min)。采用分光光度計測光密度值(620 nm)，以EB 標準曲線濃度計算腦組織中EB的含量，用mg/g 表示。

1.5 腦組織含水量測定 取大腦左右半球分別稱重，在120 ℃烤箱烘烤12 h。測大腦干濕重比(濕重-干重/濕重)×100 %。

1.6 腦梗死面積的測定 大鼠腦缺血1.5 h/再灌注48 h 后處死大鼠(治療與對照組各7 只大鼠)，在視交叉處向后切取厚度為2 mm 的冠狀切片，缺血區(qū)周邊右側(cè)腦組織用于蛋白印跡分析。TTC 染色:將腦片置于1% TTC 染液(溶解在PBS溶液中)，37 ℃避光染色10 min。掃描儀掃描，使用Image-Pro-Plus(version 5.1)圖像分析軟件計算腦梗死面積，梗死面積百分率=(梗死區(qū)腦組織面積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.7 神經(jīng)功能檢測 神經(jīng)功能評分采用兩種方法:前爪放置實驗及Longa 評分法。前爪放置實驗，用手遮住大鼠雙眼，手托大鼠將前爪置于桌子邊緣，用手輕觸大鼠鼻子側(cè)的胡須，每側(cè)碰觸10 次，結(jié)果記做:(大鼠前爪抓桌沿的次數(shù)/10)× 100%。Longa 評分法:無神經(jīng)功能損傷，記0 分;不能完全伸展左前爪，記1 分;行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，記3 分;不能自發(fā)行走且意識喪失，記4 分;死亡記5 分。

1.8 蛋白印跡分析(Western blot) 取右側(cè)剩余腦組織缺血周邊區(qū)，放入液氮中速凍，放入-80 ℃冰箱中凍存。加入3 倍體積(質(zhì)量/體積)的RIPA 裂解緩沖液［50 mmol Tris (pH7.5)，1%Triton X-100，150 mmol NaCl，0.1% SDS，1% sodium deoxycholate］，研磨及超聲裂解提取總蛋白。采用BCA 法測蛋白濃度。80 μg 蛋白在12.5%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Millipore Corporation，USA)。用5%脫脂奶粉在室溫封閉膜1 h，分別加入一抗:抗MMP-9 的多克隆抗體(1 ∶500);TIMP-1 單克隆抗體(1∶ 2000)、AQP-9 多克隆抗體(1 ∶ 500)、AQP-4 多 克 隆 抗 體(1 ∶ 500)，Phosphoglyceraldehyde Dehydrogenase(GAPDH)單克隆抗體(1∶ 2000)、4 ℃孵育過夜，HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 LRIC 能夠減輕缺血再灌注損傷后腦組織含水量 缺血/再灌注48 h 后取腦測定腦組織含水量，與對照組相比，LRIC 治療組缺血側(cè)腦組織含水量明顯低于對照組(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 LRIC 能夠改善缺血再灌注損傷后BBB的通透性 缺血/再灌注48 h 后，通過檢測腦組織中EB 的含量，檢測BBB 的通透性。兩組之間在缺血對側(cè)的EB 含量沒有顯著差異(P ＞0.05)(見表2)。與對照組相比，LRIC 治療組缺血側(cè)EB 含量顯著降低(P ＜0.05)，說明LRIC 能夠改善缺血再灌注損傷后BBB 的通透性。

2.3 LRIC 能夠改善大鼠腦梗死面積 缺血1.5 h，再灌注48 h 后取腦進行TTC 染色，結(jié)果顯示LRIC 治療組的腦梗死面積明顯低于對照組(P ＜0.01)(見表3)。

2.4 LRIC 能夠改善缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能 缺血/再灌注后立即進行Longa 神經(jīng)功能評分及前爪放置實驗，治療組與對照組之間沒有顯著差異(見表4)，說明模型的神經(jīng)功能損傷基本一致。再灌注48 h 后Longa 神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示兩組之間沒有顯著差異。然而前爪放置實驗顯示，治療組的神經(jīng)功能評分明顯低于對照組(P ＜0.05)(見表4)。

2.5 LRIC 能夠降低MMP-9 蛋白表達 缺血/再灌注48 h 后取缺血側(cè)腦組織梗死周邊區(qū)，Western blot 結(jié)果顯示:LRIC 組的MMP-9 蛋白表達明顯低于對照組(P ＜0.05)(見圖1)。然而兩組之間TIMP-1蛋白表達沒有顯著性差異(P ＞0.05)(見圖2)。

2.6 LRIC 對水通道蛋白AQP-9、AQP-4 的表達沒有影響 因為水通道蛋白與腦缺血后腦水腫具有相關(guān)性，因此我們進一步檢測了AQP-4、AQP-9 的表達，結(jié)果顯示LRIC 對AQP-4、AQP-9 的蛋白表達均沒有影響(P ＞0.05)(見圖3)。

表1 各組腦組織含水量比較(%，)

表1 各組腦組織含水量比較(%，)

與對照組比較* ＜0.05

表2 各組腦組織EB 含量比較(mg/g，)

表2 各組腦組織EB 含量比較(mg/g，)

與對照組比較* P ＜0.05

表3 各組腦梗死面積比較(%，)

表3 各組腦梗死面積比較(%，)

與對照組比較* P ＜0.05

表4 各組神經(jīng)功能評分比較(SE)

圖1 治療組與對照組MMP-9 蛋白表達。(A):MMP-9 表達的Western blot 代表圖片;(B):MMP-9 光密度分析結(jié)果＊＊P ＜0.01

圖2 治療組與對照組TIMP-1 蛋白表達。(A):TIMP-1 表達的Western blot 代表圖片;(B):TIMP-1 光密度分析結(jié)果

圖3 治療組與對照組AQP-9、AQP-4 蛋白表達。(A):AQP-9、AQP-4 表達的Western blot 代表圖片;(B):AQP-9、AQP-4 光密度分析結(jié)果

3 討論

近年，遠隔缺血期適應(yīng)對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護研究日益增多，然而其對缺血/再灌注損傷后腦水腫的影響及可能的機制尚未見報道。本研究結(jié)果顯示在大鼠缺血后給予LRIC 治療，治療組腦含水量、血腦屏障通透性、腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損程度均比對照組明顯降低。說明LRIC 可能通過減輕血腦屏障損傷從而減低腦水腫發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

腦缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生主要為BBB 破壞導(dǎo)致的血管源性水腫、細胞毒性水腫以及滲透性水腫［4］。BBB 是分隔血液與大腦的復(fù)雜的屏障系統(tǒng)，在腦缺血后，血管內(nèi)皮損傷，細胞外基質(zhì)破壞從而導(dǎo)致BBB 完整性破壞，進而引起血管源性腦水腫。MMP-9 作為鋅離子依賴的肽鏈內(nèi)切酶，能夠酶切多種細胞外基質(zhì)成分。MMP-9 主要表達在周細胞與內(nèi)皮細胞，調(diào)控血-腦屏障的完整性。在正常生理狀態(tài)下MMP-9 蛋白表達量較低，腦缺血/再灌注損傷后，表達量異常增加。缺血性腦卒中后MMP-9 高表達，并釋放入細胞間基質(zhì)，導(dǎo)致多種蛋白降解，從而加重血管損傷，引起B(yǎng)BB 的進一步破壞，最終導(dǎo)致血管源性腦水腫［7］。Maddahi 等報道，MMP 抑制劑能夠減小腦梗死面積，并抑制腦水腫［8］。本研究在缺血后給予肢體缺血適應(yīng)，再灌注48 h 后腦梗死周邊區(qū)治療組的MMP-9 蛋白表達量明顯低于對照組，說明肢體缺血適應(yīng)可能通過抑制MMP-9 的表達減輕缺血后BBB 的破壞，從而減輕腦水腫。TIMPs家族是20-29 kD 的分泌蛋白家族，其中TIMP-1 是內(nèi)源性MMP-9 抑制劑［6］。研究表明，TIMP 保護神經(jīng)細胞的凋亡和死亡，是通過影響MMP-9 調(diào)控的興奮性氨基酸毒性而實現(xiàn)的［9］。為了檢測LRIC 對TIMP-1 的影響，我們進一步檢測了腦梗死周邊區(qū)TIMP-1 的蛋白表達，結(jié)果顯示LRIC 處理對TIMP-1蛋白表達變化沒有影響。因此我們推測，LRIC 對MMP-9 的影響可能不是通過抑制TIMP-1 的表達，也可以間接說明LRIC 的神經(jīng)保護作用可能是直接通過減輕BBB 的通透性實現(xiàn)的。然而我們還沒有直接的證據(jù)證明以上假說，需要今后進一步深入研究。

在腦組織中，AQP-4 主要分布于星形膠質(zhì)細胞的足突及血管內(nèi)皮細胞，因此AQP-4 與血管具有密切相關(guān)性，血液中的水分子通過AQP-4 通道從血管腔進入星形膠質(zhì)細胞，因此與缺血后腦水腫具有相關(guān)性［7］。通過對AQP-4 基因敲除小鼠的研究表明，AQP-4 參與了腦實質(zhì)中細胞外液的清除［10］。Manley等人報道AQP-4 基因敲除小鼠腦缺血損傷后星形膠質(zhì)細胞足突的腫脹現(xiàn)象及腦水腫明顯低于野生型小鼠。預(yù)后也明顯改善［11］。AQP-9 與AQP-4 有類似的功能，二者共同參與腦缺血后水分子的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)［12］。然而我們的研究結(jié)果表明LRIC 并沒有影響腦缺血后AQP-4 及AQP-9 的表達，以上結(jié)果提示LRIC 減輕腦水腫并不是通過影響水通道蛋白的表達來實現(xiàn)的。以上研究結(jié)果也為我們今后的研究提出了問題;為什么LRIC 只調(diào)控了MMP-9 的表達，而沒有影響水通道蛋白的表達，可能LRIC 對以上蛋白的調(diào)節(jié)具有時相性，也可能調(diào)控的細胞外信號通路不同，需要我們進一步深入研究，從而明確LRIC 神經(jīng)保護的分子信號機制。

肢體遠隔缺血適應(yīng)以其操作簡便易行、設(shè)備廉價的優(yōu)勢，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究為肢體缺血適應(yīng)在急性腦血管病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

［1］Hoyte LI，Kaur J，Buchan AM.Lost in translation:taking neuroprotection from animal models to clinical trials［J］.Exp Neurol，2004，188(2):200-204.

［2］Saxena P，Newman MA，Shehatha JS，et al.Remote ischemic conditioning:evolution of the concept，mechanisms，and clinical application［J］.J Card Surg，2010，25(1):127-134.

［3］Hougaard KD，Hjort N，Zeidler D，et al.Remote ischemic perconditioning as an adjunct therapy to thrombolysis in patients with acute ischemic stroke:a randomized trial［J］.Stroke，2014，45(1):159-167.

［4］Nag SI，Manias JL，Stewart DJ.Pathology and new players in the pathogenesis of brain edema［J］.Acta Neuropathol，2009，118(2):197-217.

［5］Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases in neuroin ammation［J］.Glia，2002 39(3):279-291.

［6］Cunningham LA，Wetzel M，Rosenberg GA.Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia［J］.Glia，2005，50(4):329-339.

［7］Nag S，Manias JL，Stewart DJ，et al.Pathology and new players in the pathogenesis of brain edema［J］.Acta Neuropathol，2009，118(2):197-217.

［8］Maddahi A，Chen Q，Edvinsson L.Enhanced cerebrovascular expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 via the MEK/ERK pathway during cerebral ischemia in the rat［J］.BMC Neurosci，2009，10:56.

［9］Jourquin J，Tremblay E，Decanis N，et al.Neuronal activity-dependent increase of net matrix metalloproteinase activity is associated with MMP-9 neurotoxicity after kainate［J］.Eur J Neurosci，2003，18(6):1507-1517.

［10］Papadopoulos MC，Manley GT，Krishna S，et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema［J］.FASEB J，2004，18(11):1291-1293.

［11］Manley GT，F(xiàn)ujimura M，Ma T，et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke［J］.Nat Med，2000，6(2):159-163.

［12］Badaut JI，Brunet JF，Regli L.Aquaporins in the brain:from aqueduct to“multi-duct”［J］.Metab Brain Dis，2007，22(3～4):251-263.