井 沆，田 茂，董艷軍，官志忠，2，肖 雁

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是老年期癡呆的主要類型之一，是由一系列腦血管因素(腦組織梗死、低灌注或出血等)導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合征［1］。隨著人口老齡化和腦血管疾病發(fā)病率的上升，VaD 的發(fā)病率也逐年上升。因此，為VaD 患者提供有效地治療是亟待解決的問題。近期研究已發(fā)現(xiàn)，鈣通道及其相關(guān)信號(hào)的改變與VaD 的發(fā)生密切相關(guān)［2］，可能是引起學(xué)習(xí)記憶能力下降的主要因素。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年健康SD 大鼠60 只，購自貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心［合格證號(hào):SCXK (黔)200220001］。體重200～250 g，雌雄各半;4 周齡清潔級(jí)SD 雄性大鼠2 只(BMSCs 分離培養(yǎng)用)，自由飲食。

1.1.2 試劑 胎牛血清、低糖DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶液購于HyClone 公司。CD90、CD29、CD44、CD45 流式檢測抗體購自BD 公司。BHA、BFGF 購于美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的原代分離培養(yǎng) 取4 周齡健康SD 雄性大鼠，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，無菌條件取兩側(cè)股骨及脛骨，PBS 清洗3 次，用添加青-鏈霉素的L-DMEM 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打，將沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，1000 r/m 離心10 min，棄上清，加入事先配好的15%FBS的培養(yǎng)液，吹打均勻接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs 的純化傳代及鑒定 取P5 代已純化的BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化，4 ℃離心，1000 r/m，10 min，用PBS 清洗細(xì)胞3 次，各管分別加入流式檢測單克隆抗體CD90、CD29、CD44、CD45，同時(shí)每管樣品設(shè)立獨(dú)立同型陰性對(duì)照，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定分析。

1.2.3 BMSCs 的誘導(dǎo)鑒定和標(biāo)記 選擇第3代BMSCs，加入含10 ng/ml bFGF 的L-DMEM(10%FBS)預(yù)誘導(dǎo)24 h，更換培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，再加入含200 μmol/L BHA，2%DMSO 的無血清DMEM 誘導(dǎo)5 h，用95% 乙醇固定40 min，PBS 洗5 次×3 min，加入3%H2O2室溫避光孵育15 min，PBS 洗3次×3 min，各孔加入100 μl NSE、Nestin 一抗，4 ℃孵育過夜，對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定分析，具體步驟按照免疫組化試劑盒進(jìn)行。誘導(dǎo)后的BMSCs 于移植前24 h 在其培養(yǎng)液中加入BrdU，使其濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集標(biāo)記后的BMSCs，備用。

1.2.4 VaD 模型的制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組。大鼠術(shù)前12 h 禁食，4 h 禁水，改良四血管法進(jìn)行VaD 模型復(fù)制;對(duì)照組12 只，只分離椎動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，不進(jìn)椎動(dòng)脈凝閉和夾閉。

1.2.5 學(xué)習(xí)記憶能力測定 造模后約一個(gè)月用Morris 水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)行Morris 水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，第1～4 天進(jìn)行定向航行試驗(yàn):每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序從各入水點(diǎn)靠池壁放入水中，記錄60 s 內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(tái)(固定于第Ⅳ象限)所需時(shí)間即逃避潛伏期。每只大鼠每天訓(xùn)練4 次。第5 天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):記錄大鼠第一次穿越平臺(tái)區(qū)域的時(shí)間以及60 s 內(nèi)總的穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)。將符合VaD 標(biāo)準(zhǔn)的27 只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組:(1)模型組(n=12)，側(cè)腦室注射1 ml DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液;(2)BMSCs 組(n=15)，側(cè)腦室注射移植BMSCs 密度為1 ×106，1 ml，以1 μl/min 的速度勻速注射;移植4 w 后，模型組死亡6 只，存活6 只，BMSCs 治療組死亡2 只，存活13只。另對(duì)照組死亡5 只，存活7 只。

1.2.6 Morris 水迷宮認(rèn)知功能檢測 BMSCs移植4 w 后，通過Moris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，方法同上。

1.2.7 海馬鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)及鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII，CaMKⅡ)mRNA 表達(dá)水平 取海馬組織加入組織裂解液制備10%組織勻漿。采用Trizol 一步法提取實(shí)驗(yàn)鼠海馬組織總RNA，取3 μg RNA 樣品逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA 為模版擴(kuò)增CaM、CaMKⅡ和β-actin 基因。CaM 引物序列，上游:3’-GAACCCAACAGAGGCTGAACT-5’，下 游:5 ’ -CACGGATTTCTTCTTCGCTATC-3’，片段長度137 bp;CaMK Ⅱ引物序列，上游:3’-AATGCCAGGAGGAAACTGAAG-5’，下游:5’-ATGGTGGTGTTGGTGCTCTC-3’，片段長度134 bp;β-actin 引物序列，上游:3’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-5’，下游:5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’，片段長度115 bp。ABI Step One Plus 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀采集CaM、CaMKⅡ及內(nèi)參β-actin 擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以SDS1.4 軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行熒光收集和資料分析。SDS1.4 軟件分析其△△Ct 值及RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算各種基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 海馬CaMKⅡ蛋白表達(dá) 蛋白提取并定量，Western-blot 檢測CaMKⅡ蛋白表達(dá)。Western blot 結(jié)果用GDS-8000 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)照像，以Labworks 軟件分析結(jié)果時(shí)以β-actin 蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算CaMKⅡ蛋白條帶與β-actin 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為CaMKⅡ基因蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)水平。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮行為學(xué)測試結(jié)果 對(duì)照組、模型組和BMSCs 組移植后30 d，進(jìn)行Morris 水迷宮行為學(xué)測試。模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯長于對(duì)照組(P ＜0.05)，表明VaD 模型大鼠定向航行能力降低。第5 天觀察空間探索能力，移走平臺(tái)，以在原平臺(tái)象限(第1 象限)的活動(dòng)時(shí)間為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型組和BMSCs 組第一次穿越平臺(tái)所用時(shí)間延長(P ＜0.05)，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少(P ＜0.05)。表明VaD大鼠學(xué)習(xí)能力降低。而模型組與BMSCs 組相比，BMSCs 組逃避潛伏期明顯縮短，第一次穿越平臺(tái)時(shí)間減少，穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 海馬CaM、CaMKⅡmRNA 及海馬CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平 用Real-time PCR 方法檢測到對(duì)照組、模型組和BMSCs 細(xì)胞治療組3 組中，模型組和BMSCs 細(xì)胞治療組海馬CaM 與CaMKⅡmRNA表達(dá)水平都較對(duì)照組明顯增高(P ＜0.01)，而BMSCs 治療后海馬CaM 與CaMKⅡmRNA 表達(dá)水平較模型對(duì)照組降低(P ＜0.05)(見圖1)。

2.3 海馬CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比模型組和干細(xì)胞治療組CaMKⅡ表達(dá)水平明顯增高(P ＜0.01)，而干細(xì)胞治療后CaMKⅡ表達(dá)水平較模型對(duì)照組降低(P ＜0.05)(見圖2)。

表1 對(duì)照組、模型組和BMSCs 組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較()

表1 對(duì)照組、模型組和BMSCs 組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較()

與對(duì)照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 CaM、CaMKⅡmRNA 表達(dá)水平

圖2 海馬CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平

3 討論

在VaD 的發(fā)病機(jī)制中，鈣超載被認(rèn)為是VaD 發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要致病因素，但是鈣超載在VaD 記憶和認(rèn)知功能低下的機(jī)制尚未闡明清楚。近期研究已發(fā)現(xiàn)，鈣通道及其相關(guān)信號(hào)的改變與VaD 的發(fā)生密切相關(guān)［2］，可能是引起學(xué)習(xí)記憶能力下降的主要因素。在VaD 患者中往往由于腦組織的缺血缺氧造成大量鈣離子的內(nèi)流，然后通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體鈣通道、使鈣離子大量釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而導(dǎo)致鈣離子超載，鈣穩(wěn)態(tài)平衡被破壞，過量的鈣離子通過激活一系列的鈣依賴性酶促反應(yīng)從而促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［3，4］。

Ca2+通過與細(xì)胞內(nèi)的受體主要是CaM 相結(jié)合，使CaM 構(gòu)象發(fā)生變化，作用于鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)，然后再作用于下游的信號(hào)分子［5］。CaMKⅡ在動(dòng)物的Ca2+/CaM 介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)中起著重要作用。當(dāng)Ca2+內(nèi)流時(shí)能夠使CaMKⅡ磷酸化而被激活，活化的CaMKⅡ自身磷酸化，而且當(dāng)Ca2+下降后CaMKⅡ的活性仍能保持其狀態(tài)，推測CaMKⅡ可能是記憶的分子開關(guān)，在誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的過程中起著關(guān)鍵的作用［6］。海馬被認(rèn)為與空間記憶功能障礙密切相關(guān)［7］，特別是與年齡相關(guān)性認(rèn)知功能損害有關(guān)［8］。本研究通過對(duì)對(duì)照組、模型組和BMSCs 細(xì)胞治療組大鼠的海馬組織內(nèi)CaM、CaMKⅡmRNA 和蛋白表達(dá)水平均進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，BMSCs 組和模型組海馬組織CaM mRNA、CaMKⅡmRNA 和CaMKⅡ蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，并且與行為學(xué)上的變化相一致。而BMSCs 治療后，上述指標(biāo)降低，說明由于缺血所引起的鈣超載從而導(dǎo)致海馬組織CaM 和CaMKⅡ表達(dá)增高，在側(cè)腦室內(nèi)移植經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs 后，可能通過降低與鈣信號(hào)相關(guān)的CaM 和CaMKⅡ等的表達(dá)，來緩解缺血引起的神經(jīng)元損傷，從而改善VaD 鼠的認(rèn)知功能。

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