張 輝，陶建峰，王愛(ài)軍，孫 娜，王 茜

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病因及發(fā)病機(jī)制至今未明。有研究顯示炎癥反應(yīng)與PD 發(fā)病密切相關(guān)［1，2］。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)與前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)作為炎癥反應(yīng)的重要生物學(xué)指標(biāo)［3］，有研究顯示其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與PD 發(fā)病過(guò)程［4］。同時(shí)有報(bào)道PD 患者中腦黑質(zhì)區(qū)存在誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide，iNOS)的高度活化，iNOS 在PD 發(fā)病中與炎癥關(guān)系密切，且可能起重要作用［5］。小白菊內(nèi)酯作為艾菊的有效成分，具有抗氧化、抗炎、提高免疫力等作用［6，7］。有文獻(xiàn)報(bào)道，小白菊內(nèi)酯對(duì)MPTP 致黑質(zhì)區(qū)多巴胺(DA)能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用［8］。那么小白菊內(nèi)酯是否可通過(guò)影響炎癥反應(yīng)從而保護(hù)DA 能神經(jīng)元，為明確此問(wèn)題，本研究觀察小白菊內(nèi)酯干預(yù)后小鼠黑質(zhì)COX-2、PGE2、iNOS 表達(dá)變化的過(guò)程，探討小白菊內(nèi)酯的抗炎作用及對(duì)DA 能神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑MPTP(Sigma USA) 兔抗人COX-2單克隆抗體(福州邁新生物)，兔抗人PGE2 單克隆抗體(Cayman USA)，兔抗小鼠iNOS 單克隆抗體(福州邁新生物)，小鼠抗人TH 單克隆抗體(Chemicon USA)，UltraSensitive TMSP 超敏試劑盒(福州邁新生物)，預(yù)染蛋白Marker(天津?yàn)笊锕?，小白菊內(nèi)酯(Sigma 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性小鼠C57BL6 小鼠45 只，8～12 周齡，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXX(京)2002-0003］，自由進(jìn)食飲水，室溫(25 ±2)℃，單籠喂養(yǎng)，自然光照。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和模型制備 健康雄性C57BL6 隨機(jī)分為3 組，每組15 只。模型組:給予MPTP(30 mg/kg，鹽水溶，腹腔注射)，1 次/d，連續(xù)5 d。小白菊內(nèi)酯干預(yù)組:除給予PD 組相同的MPTP 處理外，MPTP 注射前2 h 注射小白菊內(nèi)酯(5 mg/kg，DMSO 溶，腹腔注射)，之后注射MPTP(30 mg/kg，鹽水溶，腹腔注射)，1 次/d，連續(xù)5 d。對(duì)照組:注射與PD 組和干預(yù)組等體積的鹽水。3 組小鼠均于MPTP 第5 次注射后24 h 處死。

1.3.2 標(biāo)本采集 免疫組化:每組選擇9 只小鼠麻醉后，行40 g/L 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液常規(guī)灌注固定，迅速開(kāi)顱取腦，40 g/L 多聚甲醛后固定48 h(4 ℃)，石蠟包埋切片。Western blot:每組選擇6 只小鼠麻醉后取腦，分離中腦黑質(zhì)部分，置入細(xì)胞裂解液中，低溫勻漿，4 ℃震蕩30 min 后，12000 轉(zhuǎn)4 ℃離心15 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，后用TBST(pH7.4 ±0.2)洗滌;組織抗原行水浴法熱修復(fù);3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶，正常非免疫動(dòng)物血清室溫孵育10 min;同一組織相鄰切片分別加入一抗即兔抗人COX-2 單克隆抗體(1∶ 100)、兔抗人PGE2 單克隆抗體(1∶ 300)、兔抗小鼠iNOS 單克隆抗體(1∶ 100)、小鼠抗人TH單克隆抗體(1∶ 400)，4 ℃過(guò)夜;TBST 洗滌后，加入生物素標(biāo)記二抗(1∶ 150)室溫孵育;TBST 洗滌，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶室溫孵育20 min，DAB 顯色，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察照相。

1.3.4 Western blot 取標(biāo)本蛋白定量后加入4 倍體積樣本緩沖液，95 ℃變性5 min。取20 μg 樣品在100 g/L 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 為參照，依分子質(zhì)量大小切取條帶，取相應(yīng)條帶分別加入COX-2 一抗(1∶ 400)、PGE2一抗(1∶ 600)、iNOS 一抗(1∶ 400)和TH 一抗(1∶ 1000)，4 ℃過(guò)夜，TBST 沖洗后，分別與生物素標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG 抗血清(1∶ 200)室溫震蕩孵育2 h，TBST 洗滌后，與卵白素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫下孵育0.5 h，DAB 顯色。將特異性蛋白條帶掃描后，在同一條件下應(yīng)用CMIAS 真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選定黑質(zhì)所在區(qū)域，采用CMIAS 真彩色醫(yī)學(xué)圖像免疫組化自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組每只動(dòng)物的3 張腦片數(shù)值相加后取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。分別采用單因素方差分析，q 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P ＜0.01 表示差異有顯著性。Western blot 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析同上。

2 結(jié)果

2.1 PD 模型復(fù)制成功 模型小鼠于第一次注藥后10～20 min 均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、翹尾，MPTP 最后一次注射后，模型小鼠出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、活動(dòng)減少、動(dòng)作變慢等癥狀;對(duì)照組未出現(xiàn)上述行為學(xué)變化;小白菊內(nèi)酯干預(yù)組與模型組比較上述行為學(xué)癥狀明顯減輕。

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組中腦黑質(zhì)致密部可見(jiàn)大量TH 陽(yáng)性神經(jīng)元，且排列整齊，呈條帶狀，偶見(jiàn)COX-2、PGE2、iNOS 陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。模型組與對(duì)照組相比，TH 陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少約58%，黑質(zhì)區(qū)可見(jiàn)大量COX-2、PGE2、iNOS 陽(yáng)性細(xì)胞。干預(yù)組TH 陽(yáng)性神經(jīng)元的丟失較模型組明顯為輕，僅較對(duì)照組減少約27%，且黑質(zhì)區(qū)COX-2、PGE2、iNOS 陽(yáng)性細(xì)胞較模型組有顯著減少。干預(yù)組與對(duì)照組相比炎癥因子COX-2、PGE2、iNOS 表達(dá)增多不明顯。圖像分析結(jié)果顯示，模型組、干預(yù)組、對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見(jiàn)表1)。

2.3 Western blot 檢測(cè)結(jié)果 在預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)約Mr 2000、72000、130000 和61000 處，分別可見(jiàn)PGE2、COX-2、iNOS 和TH 特異性蛋白條帶。圖像分析發(fā)現(xiàn)，模型組COX-2、PGE2、iNOS 的表達(dá)均明顯增高，TH 表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組比較，光密度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見(jiàn)表2);小白菊內(nèi)酯干預(yù)組與模型組比較，COX-2、PGE2、iNOS 的表達(dá)均顯著降低，TH 表達(dá)降低程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見(jiàn)表2);對(duì)照組僅有少量COX-2、PGE2、iNOS 的表達(dá)，干預(yù)組與對(duì)照組相比COX-2、PGE2、iNOS 表達(dá)增多不明顯。

表1 小白菊內(nèi)酯干預(yù)組對(duì)黑質(zhì)區(qū)COX-2、PGE2、iNOS 表達(dá)和TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響(n=9，)

與對(duì)照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表達(dá)水平(n=6，)

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表達(dá)水平(n=6，)

與對(duì)照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

3 討論

PD 主要病理特征為中腦黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元進(jìn)行變性缺失，其臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常等。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的PD 模型小鼠具有典型的行為學(xué)表現(xiàn);實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中腦黑質(zhì)致密部TH 免疫陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，中腦黑質(zhì)TH 蛋白表達(dá)下降，這提示本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中腦黑質(zhì)存在DA 能神經(jīng)元大量丟失，上述結(jié)果說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)PD 模型復(fù)制成功［9］。

有研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者黑質(zhì)致密部DA 能神經(jīng)元大量丟失，伴有小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生和致炎性因子高表達(dá)［10］;模型動(dòng)物中腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)存在PGE2、iNOS、TNF-α 等炎癥因子高表達(dá)，且炎性因子表達(dá)量與DA 能神經(jīng)元數(shù)量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系;抗炎性藥物可顯著減少PD 模型動(dòng)物膠質(zhì)細(xì)胞增生、致炎性因子表達(dá)和DA 能神經(jīng)元丟失［11］。這提示，炎癥反應(yīng)可能在PD 發(fā)病中起重要作用。同時(shí)iNOS 作為炎癥的反應(yīng)性酶類(lèi)，其表達(dá)與神經(jīng)元損傷。本室前期研究也表明，炎癥介質(zhì)PGE2 的關(guān)鍵限速酶COX-2以及炎癥因子iNOS 在MPTP 所致PD 動(dòng)物模型DA能神經(jīng)元丟失過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。為證實(shí)MPTP 模型中炎癥反應(yīng)與DA 能神經(jīng)元變性丟失的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了COX-2、PGE2 和iNOS 在小鼠模型中腦黑質(zhì)中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠模型建立成功之后，COX-2、PGE2 和iNOS 陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，同時(shí)伴有TH 陽(yáng)性細(xì)胞的顯著減少，提示COX-2及iNOS 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的加劇有可能參與造成黑質(zhì)區(qū)DA 能神經(jīng)元大量變性缺失。

有文獻(xiàn)報(bào)道，小白菊內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化等功能，并對(duì)MPTP 致黑質(zhì)區(qū)DA 能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用［6，7］。本研究觀察小白菊內(nèi)酯干預(yù)后小鼠黑質(zhì)COX-2、PGE2 和iNOS 陽(yáng)性細(xì)胞及蛋白水平較模型組有明顯減少，相應(yīng)的黑質(zhì)區(qū)TH 陽(yáng)性細(xì)胞和蛋白水平較模型組降低程度減輕。這提示小白菊內(nèi)酯可在一定程度上影響COX-2、PGE2 和iNOS 表達(dá)，從而減輕黑質(zhì)區(qū)的炎癥反應(yīng)，使黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元免于MPTP 誘導(dǎo)的損傷，對(duì)DA 神經(jīng)元起到一定保護(hù)作用，最終使該模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙得以改善。

本研究表明，COX-2 和iNOS 導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能參與造成PD 病DA 能神經(jīng)元的變性缺失;小白菊內(nèi)酯可通過(guò)影響COX-2、PGE2 和iNOS 的表達(dá)，起到抗炎作用進(jìn)而對(duì)小鼠多巴胺能神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用。

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