李叢言，盛寶英，韓 鳳，齊志國(guó)，張瑞雪

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是神經(jīng)退行性病變，其主要表現(xiàn)以癡呆為主，經(jīng)研究表明其為變異性疾病所致的退行性改變，與年齡有一定相關(guān)性。生活能力減低、記憶和認(rèn)知功能成時(shí)間性減退，并有不斷加重的趨勢(shì)，同時(shí)伴有行為的改變和精神神經(jīng)改變。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在全球阿爾茨海默病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1～3］。其發(fā)病機(jī)制的研究在醫(yī)學(xué)科研中逐漸被重視并予以極大的關(guān)注，但其具體的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，治療也缺乏有效的方法，對(duì)人類健康造成極大的危害。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是觀察胱氨酸在AD 模型鼠中的治療作用及其可能的機(jī)制。為AD 的治療提供有益的臨床思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品 大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供清潔級(jí)Wistar 大鼠66 只。凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于同仁化學(xué)研究所。NPM 抗體，購(gòu)于武漢博士徳生物工程有限公司。Aβ1-40購(gòu)自上海瑞奇生物科技有限公司。胱氨酸購(gòu)于Labsigma co.ltd，其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 將Wistar 大鼠66 只，隨機(jī)分為3 組，一組為正常組(n=6);一組為AD 模型組(n=30)和胱氨酸治療組(n=30)。將60只大鼠固定于腦立體定位儀上，前囟后3.8 mm，中線左2 mm，腦表面進(jìn)針3 mm，緩慢注射2 min，2 μl 凝聚態(tài)Aβ1-40(10 μg·μl-1)，留針10 min，緩慢拔出，縫合切口，術(shù)后大鼠在低溫下蘇醒。再對(duì)60 只大鼠進(jìn)行行為學(xué)驗(yàn)證，并將篩選出的AD 模型組，胱氨酸治療組行腹腔注射胱氨酸，60 只大鼠行NPM 的相關(guān)染色和檢測(cè)。Morris 水迷宮檢測(cè)AD 模型大鼠。Morris水迷宮:圓形水池直徑120 cm，深50 cm，水溫21 ℃±1.5 ℃。任選一象限在其中央放置平臺(tái)，平臺(tái)無(wú)色透明，直徑6 cm，高30 cm，液面高于平臺(tái)2 cm，水池周圍參照物固定。訓(xùn)練包括:定位航行實(shí)驗(yàn):歷時(shí)45 d，每半日為一段，每個(gè)段試驗(yàn)4 次，將Wistar 大鼠分別從4 個(gè)象限入水，記錄其找到平臺(tái)時(shí)間(逃逸潛伏期，Latency escape)與游泳路徑?？臻g探索實(shí)驗(yàn):第5 天下午撤除平臺(tái)，觀察120 s 內(nèi)雙轉(zhuǎn)基因小鼠第一次穿越平臺(tái)坐標(biāo)的時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、游泳路徑等。

1.2.2 給藥方法 為了使給藥后胱氨酸在AD模型大鼠達(dá)到較為理想的藥物濃度，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)有關(guān)說(shuō)明及該藥藥品說(shuō)明書中藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)內(nèi)容，將胱氨酸溶于滅菌注射用水(50 mg/ml)，采用腹腔注射的方法對(duì)胱氨酸組AD 模型大鼠給予注射胱氨酸(150 mg/kg/day)，1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)給予胱氨酸組AD 模型大鼠腹腔注射等劑量的胱氨酸。

1.2.3 免疫印跡法 (Western-blot)檢測(cè)AD模型大鼠海馬區(qū)NPM 因子的表達(dá)。免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。

1.2.4 r-tPCR 檢測(cè)AD 模型大鼠海馬區(qū)NPM基因的表達(dá) 參照文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)跨NPM 基因第12 外顯子的PCR 引物，上游引物:5’-TTA ACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3’;下 游 引 物:5’-CAAGACTATTTGCCATT CCTAAC-3’，產(chǎn)物大小為560 bp。PCR 擴(kuò)增體系為20 μl，PrimeSTAR DNA Ploymerization 0.5 U。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min 后，98 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序鑒定。在判定結(jié)果時(shí)，用循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)作為臨界點(diǎn)，該點(diǎn)位于PCR 產(chǎn)物進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)。50 μl PCR 反應(yīng)體積中，含5XPCR 反應(yīng)液［50 mmol/ L Tris-HCl(pH8.3)、10 mmol/L MgCl2、250 mmol/L KCl、1 mg/ml 明膠］10 μl，mdr-1 上下游引物各15 pmol/L，熒光探針10 pmol/L，Taq 酶3 U和不同樣本自100 ng RNA 逆轉(zhuǎn)得到的cDNA，同時(shí)將定量模板梯度稀釋，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 ABI PRISM7700 型實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為93 ℃預(yù)變性3 min，93 ℃40 s，55 ℃120 s 共作40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用計(jì)算機(jī)將樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得出NPM 基因表達(dá)的拷貝數(shù)。

1.2.5 TUNEL 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 根據(jù)TUNEL試劑盒操作方法行石蠟包埋各組大鼠海馬CA1區(qū)組織切片染色，選取高倍視野(400 ×)下6 個(gè)視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差行組間對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮的行為學(xué)變化 在定位航行試驗(yàn)中，AD 模型大鼠的平均逃逸潛伏期顯著長(zhǎng)于正常組大鼠(P ＜0.01)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，AD 模型大鼠在120 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)顯著少于正常組小鼠(P ＜0.01)。在定位航行試驗(yàn)中，胱氨酸干預(yù)下AD 模型大鼠的平均逃逸潛伏期顯著短于AD模型大鼠(P ＜0.01)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，胱氨酸干預(yù)下AD 模型大鼠在120 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)較AD 模型大鼠明顯增多(P ＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 海馬CA1區(qū)NPM 因子表達(dá)的變化 注射胱氨酸3 d 后，胱氨酸治療組大鼠較AD 模型大鼠NPM 因子的表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于14 d 達(dá)到高峰，此后雖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍維持在較高水平(見(jiàn)表2)。

2.3 海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的變化 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7 d后，AD 模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并于14 d后達(dá)到高峰，并持續(xù)到21 d。經(jīng)胱氨酸干預(yù)后7 d時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)減少(P ＜0.05)，于14 d 后達(dá)到最低(P ＜0.01)，21 d 時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)較干預(yù)14 d 時(shí)有所增加(P ＞0.05)(見(jiàn)表3)。

表1 Morris 水迷宮各實(shí)驗(yàn)組平均穿越次數(shù)(次，n=6，)

表1 Morris 水迷宮各實(shí)驗(yàn)組平均穿越次數(shù)(次，n=6，)

與正常對(duì)照組比* P ＜0.01;與AD 組比#P ＜0.01

表2 實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)NPM 因子表達(dá)的變化(OD 值，n=6，)

表2 實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)NPM 因子表達(dá)的變化(OD 值，n=6，)

與正常對(duì)照組比△P ＜0.05;與正常對(duì)照組比* P ＜0.01;與AD 組比#P ＜0.01

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)(個(gè)，n=6，)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)(個(gè)，n=6，)

與正常對(duì)照組比△P ＜0.05;與正常對(duì)照組比* P ＜0.01;與AD 組比▽P ＜0.05;與AD 組比#P ＜0.01

3 討論

Alzheimer 病(AD)是神經(jīng)元喪失的神經(jīng)退行性變。由于缺乏有效的治療方法，在發(fā)達(dá)國(guó)家AD 已成為繼心臟病、癌癥和卒中之后人類第四位的死因。該病的臨床特點(diǎn)是近期記憶和智力功能進(jìn)行性惡化。神經(jīng)病理學(xué)特點(diǎn)是在大腦皮質(zhì)和海馬出現(xiàn)大量的老年斑(senile plaque，SP)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrilary tangle，NFT)，并伴隨出現(xiàn)神經(jīng)元喪失。近年來(lái)許多資料表明，細(xì)胞凋亡(apoptosis)即程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)過(guò)多，引起神經(jīng)元喪失是腦組織退行性疾病發(fā)生的原因之一，內(nèi)外因素激活細(xì)胞自身基因程序而引起神經(jīng)元凋亡。有實(shí)驗(yàn)研究表明，Aβ1-40能夠誘導(dǎo)腦內(nèi)皮質(zhì)神經(jīng)元的程序性細(xì)胞死亡，并出現(xiàn)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)更多的神經(jīng)元發(fā)生凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失［5，6］。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Aβ1-40使大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡增加，減少了同源性神經(jīng)細(xì)胞的生理性補(bǔ)充作用。神經(jīng)干細(xì)胞的丟失也可能參與了神經(jīng)缺損的修復(fù)功能的減低。在神經(jīng)細(xì)胞受損后的保護(hù)機(jī)制中，神經(jīng)細(xì)胞能夠通過(guò)產(chǎn)生核磷蛋白(NPM)，后者通過(guò)間接途徑發(fā)揮抗凋亡作用，抵抗腦缺血損傷，使細(xì)胞得以存活。要挽救走向凋亡的神經(jīng)元，保護(hù)腦功能，進(jìn)行藥物干預(yù)加強(qiáng)NPM 的表達(dá)也許會(huì)是一種可行的方法。Aβ1-40損傷減少了NPM 的表達(dá)，從而削弱了其保護(hù)作用，誘發(fā)了凋亡的發(fā)生。

核磷蛋白是一種多功能的蛋白質(zhì)，參與核糖體的生物合成，控制中心體復(fù)制，具有分子伴侶作用，并可通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，NPM 在增殖活躍的細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)，產(chǎn)生過(guò)量核磷蛋白，從而起到抵抗凋亡的作用，雖然沒(méi)有證據(jù)表明NPM 直接參與凋亡機(jī)制，但它可通過(guò)間接途徑參與凋亡調(diào)控［7］。目前，有關(guān)NPM 在全腦缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面的作用及機(jī)制尚未完全明了，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究還較少。

胱氨酸是一種小分子含二硫鍵的胺鹽，具有抗氧化應(yīng)激及抑制神經(jīng)細(xì)胞退行性變的作用。近年來(lái)國(guó)外通過(guò)動(dòng)物、離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病及阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性病變研究表明胱氨酸可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，這為研究AD 患者神經(jīng)干細(xì)胞抗凋亡治療提供新的思路。但是，其抗神經(jīng)元凋亡機(jī)制及具體通路尚未明了，特別是與AD 腦細(xì)胞損傷的關(guān)系以及調(diào)控其表達(dá)的各種因素之間的關(guān)系目前尚無(wú)研究。本實(shí)驗(yàn)中可以觀察到胱氨酸干預(yù)后Aβ1-40對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷作用減弱，凋亡發(fā)生率減低，同時(shí)NPM 表達(dá)有所上調(diào)，其作用途徑是否由于NPM 上調(diào)從而起到細(xì)胞保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。

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