李世平，劉 露，張美月，王 彬，劉瑞春，郭 力，董 梅

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性疾病，兼有軸索損傷，發(fā)病機制尚不清楚，新近研究表明，MS 患者CD4+CD25+Foxp3+Tregs 數(shù)目和/或功能異常，暗示其在MS 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關鍵的作用［1，2］。CD4+CD25+Foxp3+Tregs 以Foxp3 為特異性的標志，是其發(fā)育和功能的關鍵調節(jié)因子，在維持外周免疫耐受、預防自身免疫性疾病的發(fā)生方面起著重要作用［3］。HO-1 是亞鐵血紅素代謝途中的限速酶，它及其催化產(chǎn)物具有抗氧化、清除自由基的功能，同時其在CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上的表達上調也能促進后者的發(fā)育和功能，抑制效應型T 細胞的產(chǎn)生，從而調節(jié)免疫平衡［4］。

依達拉奉(Edaravone)是一種新型的氧自由基清除劑，能保護血管內皮細胞和神經(jīng)細胞免受氧化損傷。最近有證據(jù)表明依達拉奉能顯著減輕EAE的臨床癥狀，減少脊髓中淋巴細胞的浸潤［5］，對MS可能具有治療價值，但治療機制尚不明確，有待于進一步研究。我們通過免疫Wistar 大鼠建立EAE 動物模型，觀察依達拉奉對EAE 大鼠是否有治療作用，并探討其對疾病治療可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑器材

1.1.1 實驗動物 健康雌性Wistar 大鼠180只，6～8 周齡，體重180～220 g;清潔級豚鼠8 只，雌雄不限，體重在350～450 g 之間，均購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號SCXK 冀2008-1-003)。

1.1.2 試劑及儀器 佐劑用卡介苗60 mg/支(北京生物制品研究所)，依達拉奉注射液5 ml/10 mg(南京先聲東元制藥有限公司)，反義核酸第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR qPCR 綠色體系(加拿大Fermentas 公司)。石蠟切片機(德國LEICA 公司)，光學顯微鏡(日本Nikon 公司)，ABI PRISM 7300 熒光PCR 儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠適應性喂養(yǎng)2 w，隨機分為3 組EAE 組、依達拉奉組和對照組。根據(jù)EAE 動物發(fā)病規(guī)律，將每組實驗動物又分為3 個發(fā)病時期進行研究。大鼠最早發(fā)病為免疫后12 d;發(fā)病高峰為病后3～5 d，我們將免疫后第10 天取材記為發(fā)病前組，發(fā)病后第3 天取材記為高峰期組，發(fā)病后第7 天取材記為緩解期組。

1.2.2 EAE 模型的制備 取新鮮豚鼠全脊髓組織與生理鹽水按1∶ 10 的比例混合勻漿，再加入含有6 mg/ml 卡介苗的完全福氏佐劑(CFA)充分混合成油包水狀乳劑，按0.5 ml/大鼠于四足墊及背部以0.1 ml/部位皮下注射免疫動物，誘導EAE 模型的建立。

1.2.3 藥物干預 免疫當天記為第0 天，當天即給予依達拉奉組大鼠每只10 mg/kg(約為1 ml/大鼠)依達拉奉注射液腹腔內注射干預治療，同時給予EAE 組和對照組大鼠等劑量生理鹽水腹腔內注射作為對照，以后每天一次，持續(xù)至處死。

1.2.4 行為學觀察 自免疫后第一天開始，每天分上、下午兩次觀察大鼠精神狀態(tài)、活動情況，記錄大鼠的發(fā)病起始日期，并參照通用的評分標準對發(fā)病的大鼠進行神經(jīng)功能評分:0 分:不發(fā)病;1 分:動物尾部無力;2 分:后肢輕度癱瘓+步態(tài)不穩(wěn);3分:中度癱瘓但自主運動保存;4 分:肢體嚴重癱瘓，自主運動不能;5 分:瀕死狀態(tài)。癥狀介于兩標準之間者以±0.5 分計。

1.2.5 病理學觀察及免疫組化檢測脊髓中Foxp3 和HO-1 的表達 將大鼠用4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓腰膨大常規(guī)石蠟切片，HE 染色，觀察組織病理學改變，免疫組化測定Foxp3 和HO-1 陽性細胞表達。

1.2.6 Real-time PCR 檢測脊髓中Foxp3 mRNA 和HO-1 mRNA 的含量 (1)總RNA 提取及逆轉錄反應:取大鼠脊髓腰膨大組織，采用Trizol 法抽提總RNA，將樣本稀釋后進行逆轉錄，反應體系:5×Buffer 4 μl，RNA 酶抑制劑1 μl，10 mM dNTP Mix 2 μl，M-MULV 反轉錄酶1 μl，隨機六聚體引物1 μl，總RNA 和去離子水，反應總體系20 μl。反應程序:加熱25 ℃5 min→42 ℃60 min→70 ℃5 min→終止反應。(2)Real-time PCR 擴增，按說明書稀釋引物(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR 擴增反應體系:qPCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各1 μl，模板cDNA2 μl，去離子水8.5 μl 至終濃度25 μl。擴增程序:UDG-預處理50 ℃2 min 1 個循環(huán)→起始變性95 ℃10 min 1 個循環(huán)→變性95 ℃15 s、退火60 ℃30 s、延伸72 ℃30 s 40 個循環(huán)→反應終止。儀器自動匯總熒光值后進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行分析，發(fā)病率以百分數(shù)表示，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，相關性采用Liner Correlation，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物發(fā)病情況 EAE 組大鼠自免疫后第10 天開始出現(xiàn)食欲不振、活動減少等現(xiàn)象，免疫后第12 天開始陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率為80.4%，依達拉奉組大鼠發(fā)病前不適癥狀較少，起病時間及發(fā)病率均晚于EAE 組(P ＜0.05)，且發(fā)病第3 天神經(jīng)功能評分依達拉奉組也低于EAE 組(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 病理學表現(xiàn) EAE 組大鼠發(fā)病前期脊髓組織有散在炎性細胞浸潤，高峰期可見炎性細胞彌漫性浸潤，多數(shù)小血管周圍出現(xiàn)典型“袖套樣”改變，緩解期炎性細胞和“血管袖套”減少。依達拉奉組各時期炎性細胞浸潤程度均小于EAE 組(見圖1)。

2.3 脊髓組織中Foxp3 和HO-1 陽性細胞表達EAE 組脊髓中不同時期Foxp3 和HO-1 陽性細胞計數(shù)均較同期對照組明顯增高(P ＜0.05)，且隨著疾病發(fā)展，發(fā)病高峰期與發(fā)病前期相比及緩解期與高峰期相比數(shù)量均顯著增高(P ＜0.05)。Edaravone干預后，與EAE 組各時期對比，各指標數(shù)量均明顯增加(P ＜0.05)，其中高峰期增加最明顯，高于發(fā)病前期及恢復期(P ＜0.05，見表2、表3)。

2.4 脊髓中Foxp3 mRNA 和HO-1 mRNA 表達EAE 組炎癥因子Foxp3 mRNA 表達在發(fā)病前期即開始增高，急性期明顯增高，疾病好轉后仍繼續(xù)增高(P ＜0.05)。Edaravone 組Foxp3 mRNA 表達在發(fā)病高峰期迅速明顯增高，恢復期略有下降，但均高于同期EAE 組(P ＜0.05)。EAE 組HO-1 mRNA 含量同樣隨疾病進展而增高(P ＜0.05)，Edaravone 組同樣在疾病高峰期HO-1 mRNA 含量最高，恢復期稍降低，但均高于EAE 組(P ＜0.05，見表4、表5)。

2.5 Foxp3 和HO-1 相關性檢驗 EAE 組及Edaravone 組脊髓中HO-1 mRNA 與Foxp3 mRNA 含量呈顯著的正相關性(P ＜0.05，r ＞0)。

表1 大鼠發(fā)病情況比較

表2 3 組中不同時期脊髓中Foxp3 陽性細胞表達數(shù)目的比較()

表2 3 組中不同時期脊髓中Foxp3 陽性細胞表達數(shù)目的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表3 3 組中不同時期脊髓中HO-1 陽性細胞表達數(shù)目的比較()

表3 3 組中不同時期脊髓中HO-1 陽性細胞表達數(shù)目的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表4 3 組中不同時期脊髓中Foxp 表達的比較()

表4 3 組中不同時期脊髓中Foxp 表達的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表5 3 組中不同時期脊髓中HO-1 表達的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 天組與發(fā)病3 天組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 天組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

3 討論

MS 是CNS 炎性脫髓鞘性疾病，青年女性多見，致殘率高，發(fā)病機制尚不完全清楚，目前多推崇免疫和氧化應激兩種學說。CD4+CD25+Foxp3+Tregs，是一個特殊的CD4+T 細胞亞群，在維持自身免疫耐受、限制免疫反應方面發(fā)揮著關鍵的作用。轉錄因子Foxp3 是其特異性的標志，在其表面有唯一表達，也是其發(fā)育和功能的主要調節(jié)者［6］。正常情況下，初始T 細胞在外周TGF-β 或某些因素作用下可轉變?yōu)門reg，但在炎癥存在時，大量產(chǎn)生的IL-6 可與TGF-β 共同抑制這種轉變，并促使初始T 細胞轉變?yōu)橹鲗庖叻磻腡h17 細胞。

研究證明CD4+CD25+Foxp3+Tregs 能組成性的表達HO-1，HO-1 也能通過抑制Th17 亞群的發(fā)育或上調CD4+CD25+Foxp3+Tregs 協(xié)調CD4+CD25+Foxp3+Tregs 與Th17 亞群之間的免疫平衡，在多種疾病在發(fā)揮保護作用［7，8］。也有研究表明，具有抗氧化作用的促紅細胞生成素可以通過增強HO-1 的表達，減輕EAE 發(fā)病的免疫反應和炎癥程度［9］，故HO-1 是脫髓鞘疾病氧化應激過程中重要的保護性分子，本研究中可見發(fā)病前期，EAE 組大鼠出現(xiàn)食欲減退和活動減少，脊髓組織可見少量炎性細胞浸潤，F(xiàn)oxp3 和HO-1在組化中的表達及mRNA 含量均增加，提示EAE 出現(xiàn)臨床癥狀前已發(fā)生細胞和因子水平的改變。

EAE 組大鼠在發(fā)病后第3 天臨床表現(xiàn)最重，神經(jīng)功能評分最高，脊髓病理染色可以觀察到在灰白質交界區(qū)有彌漫性的炎性細胞浸潤和大量的“血管袖套”形成，脊髓中Foxp3 的mRNA 含量均較對照組顯著增多，提示持續(xù)的炎癥刺激導致靶器官中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs 繼續(xù)擴增，以限制炎癥反應。EAE組大鼠脊髓中HO-1 的mRNA 含量均較發(fā)病前顯著增加，且均較同時期對照組顯著增多，提示在這一時期表達HO-1 的細胞進一步增多，HO-1 更新進一步加快以對抗氧化應激并調節(jié)免疫平衡。HO-1 即表達在CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上的，又表達在神經(jīng)元、內皮細胞和小膠質細胞。在劇烈的炎癥環(huán)境下，一方面表達在神經(jīng)元和小膠質細胞上的HO-1 通過催化降解促氧化劑血紅素生成具有清除自由基功能的膽綠素和膽紅素，以及具有抗凋亡和抗炎特性的一氧化碳(CO)，發(fā)揮抗氧化作用;另一方面，CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上HO-1 的表達可促進其發(fā)育和Foxp3的表達上調［10］。由此產(chǎn)生了一個正反饋的途徑促使CD4+CD25+Foxp3+Tregs 發(fā)揮細胞因子效應。發(fā)病后第7 天EAE 大鼠的臨床癥狀開始緩解，神經(jīng)功能評分顯著降低，脊髓Foxp3 的mRNA 含量較高峰期進一步增加，提示CD4+CD25+Foxp3+Tregs 在靶器官中持續(xù)增加促進了炎癥的消散和疾病的緩解EAE 組大鼠脊髓中HO-1 的mRNA 含量較發(fā)病后第3 天顯著增加，且顯著高于對照組，提示其可能與CD4+CD25+Foxp3+Tregs 協(xié)同促進EAE 病程的緩解。

依達拉奉是一種小分子自由基清除劑，有報道稱其能改善EAE 的臨床癥狀，但具體機制尚不十分明確。本研究中觀察到使用依達拉奉干預的大鼠起病時間明顯延遲，發(fā)病率明顯降低，發(fā)病前食欲不振、皮毛不光滑等不適癥狀少見，發(fā)病后第3 天和第7 天神經(jīng)功能評分均顯著低于EAE 組，各時期脊髓組織切片HE 染色炎性細胞和“血管袖套”均較EAE組顯著減少，說明依達拉奉對EAE 有明顯的治療效果。依達拉奉干預治療后各時期脊髓中Foxp3 和HO-1 的mRNA 含量較同時期EAE 組顯著增加，提示依達拉奉能促進CD4+CD25+Foxp3+Tregs 和HO-1 的更新，而這種作用似乎在疾病的早期更為明顯。因此依達拉奉對EAE/MS 的治療作用可能是通過促進HO-1 的抗氧化并調節(jié)免疫反應的作用以及促進CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的發(fā)育和功能實現(xiàn)的。

圖1 各組小鼠發(fā)病不同時期脊髓HE 染色(IHC，×400)

綜上所述，依達拉奉作用途徑廣泛，副作用較少，對EAE 具有治療作用，尤其在疾病早期作用更明顯，同時價格相對低廉，對MS 具有極大的治療價值。

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