朱 江，竇志杰，王維興，丁 萌，周志強(qiáng)

缺血性腦血管病是各種原因所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能損傷［1］。缺血后腦組織中微血管的分布密度的變化是反應(yīng)腦組織血液供應(yīng)情況的一個(gè)重要指標(biāo)。腦組織血液供應(yīng)障礙勢(shì)必會(huì)對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子造成相應(yīng)影響。近年來(lái)對(duì)缺血性腦血管病損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)已進(jìn)入分子水平［2］，其中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可以明顯促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要的作用［3］。丁苯酞氯化鈉注射液(butylphthalide)具有清除自由基和神經(jīng)保護(hù)作用，可增強(qiáng)局部腦血流［4］，改善腦缺血后的能量代謝，減輕神經(jīng)功能損傷的程度［5］。本研究從丁苯酞氯化鈉注射液對(duì)大鼠延髓缺血腦組織中NGF 和BDNF 表達(dá)的改變及其最終對(duì)微血管分布的影響的角度，對(duì)丁苯酞氯化鈉注射液在延髓缺血過(guò)程中起到的保護(hù)作用進(jìn)行深入的探討。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)Wistar 成年健康雄性大鼠220～260 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。60 只大鼠隨機(jī)分為3 組:假手術(shù)組、丁苯酞治療組、缺血對(duì)照組。其中假手術(shù)組每組6 只大鼠，其余按時(shí)間點(diǎn)分為7 d、14 d 兩個(gè)亞組，每組12 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動(dòng)脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開(kāi)肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動(dòng)脈3～4 s，檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對(duì)照組均在阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈后立即開(kāi)始治療。治療組每天腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液兩次，時(shí)間間隔12 h，每次注射計(jì)量按3 mg/kg 計(jì)算，到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。缺血對(duì)照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時(shí)間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 應(yīng)用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開(kāi)腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37 ℃)100 ml，同時(shí)用眼科剪剪破右心耳，此時(shí)血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol 磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結(jié)束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 觀察指標(biāo) (1)單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度:每只大鼠取3 張切片，采用Simple PCI-8 圖像分析軟件分析腦組織微血管灰度。每張切片在光鏡下選5 個(gè)視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級(jí)為0～256 灰級(jí)，平均灰度表示陽(yáng)性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級(jí)越高，說(shuō)明反應(yīng)強(qiáng)度越低。(2)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子:NGF、BDNF 蛋白表達(dá)的測(cè)定用SP 免疫組織化學(xué)染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設(shè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照用PBS 替代一抗孵育切片。結(jié)果判定:陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析:用Simple PCI-8 圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每張切片在光鏡下選5 個(gè)視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級(jí)為0～256灰級(jí)，平均灰度表示陽(yáng)性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級(jí)越高，說(shuō)明反應(yīng)強(qiáng)度越低。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織中NGF、BDNF 灰度值的變化通過(guò)對(duì)7 d、14 d 后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，治療組及缺血對(duì)照組中灰度值較假手術(shù)組顯著增加。但是，治療組NGF、BDNF 灰度值增加的程度低于缺血對(duì)照組NGF、BDNF 灰度值增加的程度。其中，治療組各時(shí)段NGF、BDNF 灰度值均低于缺血對(duì)照組。與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1、表2)。

2.2 各組腦組織中微血管灰度的變化 通過(guò)對(duì)7 d、14 d 后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，治療組及缺血對(duì)照組的微血管灰度值較假手術(shù)組均增加。治療組數(shù)值增加的幅度低于缺血對(duì)照組。其中，治療組微血管灰度值在各時(shí)段均低于缺血對(duì)照組。與假手術(shù)組相比較二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表3)。

表1 各組大鼠腦組織中NGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)灰度值比較()

表1 各組大鼠腦組織中NGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)灰度值比較()

與假手術(shù)組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表2 各組大鼠腦組織中BDNF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)灰度值比較()

表2 各組大鼠腦組織中BDNF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)灰度值比較()

與假手術(shù)組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較()

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較()

與假手術(shù)組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

3 討論

BDNF 和NGF 具有多種生物活性，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腦缺血后，腦神經(jīng)元損傷的程度與BDNF 和NGF 的表達(dá)水平密切相關(guān)［6，7］。腦缺血后，BDNF、NGF 均增加［8］，通過(guò)拮抗興奮性氨基酸毒性，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，增強(qiáng)蛋白激酶活性，保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)［9］。

在延髓缺血后，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量及微血管密度的減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，引起局部微循環(huán)障礙，即微血管凋亡的數(shù)量大于其新生的數(shù)量［10，11］。研究發(fā)現(xiàn)BDNF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化與分裂，刺激神經(jīng)血管的生成［12］。

丁苯酞是一種新型抗腦缺血藥物，可通過(guò)解除微血管痙攣、抑制血小板聚集，抑制TXA2 的合成等多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷腦缺血引起的病理過(guò)程。丁苯酞能清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元［13］，提高BDNF、NGF 水平，進(jìn)一步影響血管新生數(shù)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，在延髓缺血狀態(tài)下，與假手術(shù)組相比較，治療組微血管灰度值增加的程度明顯低于缺血對(duì)照組;治療組NGF、BDNF 的灰度值增加的程度明顯低于缺血對(duì)照組;與缺血對(duì)照組相比較，丁苯酞氯化鈉注射液治療7 d、14 d 時(shí)微血管灰度降低趨勢(shì)與BDNF、NGF 灰度值降低趨勢(shì)呈正相關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腦組織慢性缺血的前提下，治療組中NGF、BDNF 表達(dá)水平升高，提示丁苯酞氯化鈉注射液不僅具備清除自由基的作用，還可以通過(guò)激發(fā)神經(jīng)生長(zhǎng)因子途徑對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。更重要的是，微血管密度增加可從根本途徑上改善腦組織缺血造成的損傷。同時(shí)提示微血管密度增加可促進(jìn)NGF、BDNF 的表達(dá)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子又進(jìn)一步刺激微血管新生，即二者之間是相互促進(jìn)的正性刺激過(guò)程。

［1］黃如訓(xùn)，李常新，陳立云，等.丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈血栓形成性腦梗死的治療作用［J］.中國(guó)新藥雜志，2005，14(8):985 -988.

［2］韓 凡，劉吉昌.依達(dá)拉奉對(duì)急性腦梗死患者血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子水平的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32(14):2940 -2941.

［3］孫春艷，胡 豫，王雅丹，等.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中的表達(dá)增高及其意義的初步探討［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005，13(1):104 -109.

［4］Yan CH，F(xiàn)eng YP，Zhang JT.Effects of dl-3-n-butylphthalide on regional cerebral blood flow in right middle cerebral artery occlusion rats［J］.Acta Pharmacol Sin，1998，19(3):117 -119.

［5］Kalaria RN.The role of cerebral ischemia in Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2000，21(2):321 -330.

［6］Takeda A，Onddera H，Sugimoto A，et al.Coordinated expression of messenger RNAs for nerve growth factor，brain-derived neurotrophic factor and nerotrophin-3 in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia［J］.Neuroscience，1993，55(1):23 -31.

［7］Hsu CY，An G，Liu JS，et al.Expression of immediate early gene and growth factor mRNAs in a focal cerebral ischemia model in the rat［J］.Stroke，2001，24(12):178 -181.

［8］Gura T.Inna immunity ancient system gets new respect［J］.Science，2001，291(5511):2068 -2071.

［9］Lemaitre B，Reichhart JM.Drosophilia host defense differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganism［J］.Proc Natl A cad Sci USA，1997，94(26):14614-14619.

［10］Barde YA，Edgar D，Thoenen M.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain［J］.EMBO J，1982，1(5):549 -530.

［11］Ferrer I，Krupinski J，Goutan E，et al.Induction of brain-derived neurotrophic factor and the receptor trkB mRNA following middle cerebral artery occlusion in rat［J］.Neurosci Lett，1996，211(1):57 -60.

［12］Arai S，Kinouchi H，Akabane A，et al.Brain-derived neurotrophic factor reduces cortical cell death by ischemia after middle cerebral artery occlusion in the rat［J］.Acta Neuropathol，2001，101(2):229 -232.

［13］Wolters FJ，Rinkel GJ，Vergouwen MD.Clinical course and treament of vertebrobasilar dolichoectasia:a systematic review of the literature［J］.Neurol Res，2013，35(2):131 -137.