馬向陽(yáng)，王永新，張麗萍，劉冬梅，楊 揚(yáng)

腦血管病特別是腦卒中是當(dāng)前社會(huì)最常見(jiàn)的疾病之一，死亡率和致殘率高。近年來(lái)，腦卒中的康復(fù)日益受到重視，康復(fù)治療和訓(xùn)練在腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)中的重要性得到肯定，而腦的可塑性和功能重組是腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)主要機(jī)制，有研究證實(shí)腦的可塑性受學(xué)習(xí)訓(xùn)練的影響［1］。為進(jìn)一步研究探索學(xué)習(xí)對(duì)腦損傷修復(fù)的作用機(jī)制，本研究探討對(duì)局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flt-1 表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用探索學(xué)習(xí)于腦卒中康復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD 大鼠80 只，3～4 月齡，體質(zhì)量230～260 g，購(gòu)自河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.2 制作MCAO 模型及分組 參照賈子善等的方法［2］制作MCAO 模型。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100g 體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠，左側(cè)側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒后，在右眼與右耳之間切開(kāi)皮膚，分離顳肌，暴露顳骨翼板，術(shù)中避免損傷面神經(jīng)、面部主要?jiǎng)用}、靜脈、眼外肌及淚腺和顴弓。在手術(shù)顯微鏡下，用牙鉆經(jīng)顳骨翼板鉆至硬腦膜，暴露大腦中動(dòng)脈后，用小咬骨鉗向下咬去部分顱骨，用電凝器閉塞嗅束近端至大腦下靜脈之間的一段大腦中動(dòng)脈，依次縫合顳肌及皮膚。腹腔內(nèi)注射0.2 萬(wàn)單位青霉素以預(yù)防感染。共用大鼠114 只，有80 只符合入選條件(蘇醒后右眼出現(xiàn)Horner 征及左側(cè)肢體偏癱)并存活到規(guī)定時(shí)間。術(shù)后24 h 將大鼠隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(SE)組，探索學(xué)習(xí)(LE)組各40 只。

1.3 造模后飼養(yǎng)環(huán)境 (1)SE 組飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠(290 mm×178 mm×160 mm)，每籠5 只;(2)LE組:飼養(yǎng)于參考文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)的迷宮籠，一籠20 只，迷宮籠由一個(gè)圓籠與一個(gè)方籠組成，直徑500 mm 圓籠同640 mm×480 mm×120 mm 方籠中間通過(guò)兩通道相連(圓籠中間由絲網(wǎng)分隔，一側(cè)為進(jìn)食區(qū)，一側(cè)為飲水區(qū);方籠:由絲網(wǎng)分隔形成通道寬80 mm ×80 mm的迷宮。迷宮由易到難，每周變換一次)。

1.4 標(biāo)本的制備 兩組分別于術(shù)后1、3、7、14、28 d 各隨機(jī)取5 只大鼠，用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，用9#針頭插入左心室，灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開(kāi)右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無(wú)色透明時(shí)，開(kāi)始用4%多聚甲醛灌注固定，每只大鼠約需200 ml，總量在20～30 min 內(nèi)灌完，立即在視交叉處切開(kāi)后取出大腦，浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做7 μm厚連續(xù)切片，每隔100 μm 連續(xù)取3 張，相鄰切片分為2 套，分別用于微血管密度和Flt-1 的免疫組化測(cè)定。

1.5 Flt-1 免疫組化實(shí)驗(yàn) 采用免疫組織化學(xué)ASB 法檢測(cè)Flt-1，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將腦組織切片，60 ℃烤箱內(nèi)烘烤2 h 后，放于4 ℃冰箱內(nèi)備用。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后依次經(jīng)過(guò)100%、95%、80%乙醇脫水;3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，抗原熱修復(fù)后，滴加一抗，37 ℃孵育20 min;滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察至顯色較好時(shí)，終止顯色，依次經(jīng)蘇木素復(fù)染，2%鹽酸乙醇分色，藍(lán)化;經(jīng)80%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，最后封片，貼標(biāo)簽備查。

1.6 微血管密度(Microvesseldensity，MVD)測(cè)定 MVD 計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)方法［4］，凡CD34 免疫組織化學(xué)染色成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片在同一缺血側(cè)海馬區(qū)選擇4 個(gè)高倍(×400)視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算每mm2面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即MVD，然后求其均值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組有15 張切片結(jié)果。

1.7 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS7.5 版軟件系統(tǒng)圖像采集卡、顯微鏡全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片于10×40 放大倍數(shù)下，采用雙盲法從缺血側(cè)海馬區(qū)隨機(jī)選5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野Flt-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微血管密度比較 CD34 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞圍成。SE、LE 組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)14 d和28 d 時(shí)可見(jiàn)較多散在的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，LE 組14 d和28 d 時(shí)微血管密度明顯多于相應(yīng)時(shí)間的SE 組，差異有顯著性意義(P ＜0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。

2.2 Flt-1 免疫組化染色結(jié)果 SE 組、LE 組大鼠MCAO 術(shù)后1 d 時(shí)，缺血側(cè)海馬區(qū)Flt-1 表達(dá)最高，第3 天明顯下降，7 d 時(shí)仍有表達(dá)，14 d 時(shí)表達(dá)基本恢復(fù)正常(見(jiàn)圖2)。1 d、3 d、7 d 時(shí)LE 組Flt-1 在缺血側(cè)海馬區(qū)的表達(dá)均明顯高于SE 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

表1 兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度比較()血管數(shù)/mm2

表1 兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度比較()血管數(shù)/mm2

與SE 組比較* P ＜0.05

表2 兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)Flt-1 陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)比較(個(gè)，)

表2 兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)Flt-1 陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)比較(個(gè)，)

與SE 組比較* P ＜0.05

3 討論

腦血管閉塞以后，神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸受多種因素的影響，其中血供的恢復(fù)是重要因素。血管新生是決定缺血性神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素，與缺血性腦卒中患者的預(yù)后關(guān)系密切［5］，Marti 等［6］的研究表明，在大腦中動(dòng)脈閉塞后，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與受體(VEGF/VEGFR)系統(tǒng)可以誘導(dǎo)大腦缺血后新血管的形成，新形成的側(cè)支血管可改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，其增生的范圍和程度直接關(guān)系到梗死灶周圍血流的改善，影響神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)［7］;此外，血管生成還可以通過(guò)改善神經(jīng)干細(xì)胞成體生發(fā)區(qū)的血管微環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖［8］，從而進(jìn)一步促進(jìn)腦梗死神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前較肯定的VEGF 家族受體共有Flt-1(Fms-like tyrosine-1，VEGF-1)、Flk-1(VEGF-2)、Flt-4(VEGF-3)、np-1(神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白-1)、np-2(神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白-2)等［9］。VEGFR 的生物學(xué)效應(yīng)主要為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷徙，這是VEGF 和VEGFR 結(jié)合后最明顯的生物學(xué)效應(yīng);另外還有增加血管的通透性及神經(jīng)保護(hù)作用［10］，在促進(jìn)新生血管生成的過(guò)程中，不同的受體具有各自特異的生物學(xué)特性。目前，在腦梗死中研究最多的是Flt-1［10］，對(duì)VEGF 非常敏感，參與完成血管的新生。本實(shí)驗(yàn)選擇Flt-1 為VEGF 受體的代表進(jìn)行研究。探索學(xué)習(xí)環(huán)境由社會(huì)交往、探索學(xué)習(xí)和體力活動(dòng)等成分構(gòu)成［11］，對(duì)成年腦損傷動(dòng)物的研究已證實(shí)，探索學(xué)習(xí)環(huán)境能減輕腦損傷，改善腦功能，促進(jìn)腦損傷修復(fù)［12］。

圖1 缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度表達(dá)，染色法:×400

圖2 海馬區(qū)Flt-1 表達(dá)，染色法:×400

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCAO 術(shù)后1 d 缺血側(cè)海馬區(qū)Flt-1 表達(dá)最高，第3 天明顯下降，1 d、3 d、7 d 時(shí)LE組Flt-1 在缺血側(cè)海馬區(qū)的表達(dá)均明顯高于SE 組。兩組Flt-1 在MCAO 后均有表達(dá)，LE 組表達(dá)明顯高于SE 組，提示探索學(xué)習(xí)可以促進(jìn)Flt-1 的表達(dá)。說(shuō)明腦梗死缺血缺氧可以誘使海馬區(qū)Flt-1 表達(dá)，探索學(xué)習(xí)環(huán)境干預(yù)可促進(jìn)兩者的表達(dá)。對(duì)MCAO 后大鼠MVD 的分析結(jié)果顯示，術(shù)后14 d 和28 d 時(shí)兩組缺血側(cè)海馬區(qū)均有微血管表達(dá)，而LE 組又明顯多于相應(yīng)時(shí)間的SE 組，說(shuō)明探索學(xué)習(xí)環(huán)境對(duì)MCAO 后缺血側(cè)海馬區(qū)微血管增生有促進(jìn)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，MCAO 后微血管明顯增生的時(shí)間在術(shù)后14 d 和28 d，明顯晚于Flt-1 表達(dá)的時(shí)間。以往結(jié)果顯示［13］，LE 干預(yù)后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到顯著改善，幾乎恢復(fù)到正常水平。說(shuō)明探索學(xué)習(xí)可使動(dòng)物不斷地主動(dòng)學(xué)習(xí)、接受新的信息而改變自身行為、適應(yīng)新的環(huán)境、不斷用新的記憶取代舊的記憶，可能是先通過(guò)促進(jìn)腦缺血缺氧后海馬區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，繼而依靠與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的相互結(jié)合對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起著直接的保護(hù)作用，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，直到新血管形成，從而促進(jìn)海馬區(qū)微血管新生，改善側(cè)支循環(huán)，進(jìn)而改善腦缺血后海馬區(qū)血流量，改善學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能。這可能是探索學(xué)習(xí)環(huán)境促進(jìn)腦缺血后記憶功能恢復(fù)的一個(gè)重要機(jī)制。

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