張海清，孔慶霞

癲癇(epilepsy)是大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的短暫性大腦功能障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與癲癇的關(guān)系密不可分，腦內(nèi)特定區(qū)域的炎癥反應(yīng)是其共同的本質(zhì)特征［1］，炎癥反應(yīng)可以降低癇性發(fā)作的閾值、增加神經(jīng)元興奮性、破壞血腦屏障、介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及突觸重塑［2］。在多種癲癇動物模型中均觀察到與癲癇活動相關(guān)的腦區(qū)中膠質(zhì)細胞活化、炎性因子水平增高，包括白細胞介素-1β (IL-1β)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNFα)等細胞因子的釋放［3］。在難治性癲癇患者手術(shù)切除腦組織及癲癇動物模型中均證實存在IL-1β 表達水平異常升高，Mattia 等發(fā)現(xiàn)患者腦組織中IL-1β升高水平與其術(shù)前癇性發(fā)作的嚴重程度成正相關(guān)［4］。有研究顯示給予IL-1 受體拮抗劑(IL-1ra)或者抑制IL-1β 前體轉(zhuǎn)化酶活性(pralnacasan 或VX-765)能有效發(fā)揮抗癇作用，但是不能改善癲癇造成的病理改變，考慮與不能完全抑制IL-1β 的生物活性有關(guān)［5］。本實驗通過氯化鋰-匹羅卡品建立顳葉癲癇模型，通過IL-1β 單克隆抗體中和IL-1β，觀察IL-1β 單克隆抗體對大鼠癲癇IL-1β mRNA、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB mRNA、神經(jīng)損傷標志物S100B、膠質(zhì)細胞活化及神經(jīng)元凋亡的影響，旨在探討IL-1β 單克隆抗體對氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)的作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料及實驗分組 健康雄性Sprague Dawley 大鼠72 只(山東魯抗實驗動物中心，生產(chǎn)許可證scxk 魯20130001)，體重250～300 g。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(20 只)、模型組(26 只)、IL-1β 單克隆抗體治療組(26 只)。匹羅卡品、氯化鋰(美國SIGMA);IL-1β 單克隆抗體(美國R＆D)、無標記兔抗小鼠抗體(武漢博士德)、HRP 標記羊抗兔(武漢博士德)、兔抗大鼠GFAP-Cy3 標記(美國abcam)、兔抗大鼠Iba1(日本wako)、FITC 標記驢抗兔二抗(美國abcam);總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京天根生物科技)，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計合成;BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD);Leica 熒光顯微鏡(德國萊卡);大鼠S100B ELISA 試劑盒(武漢華美)。

1.2 動物模型制備 氯化鋰-匹羅卡品法制備癲癇模型，方法如下:大鼠腹腔內(nèi)提前18～20 h 預(yù)先注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg，第2 天提前30 min預(yù)先給予大鼠腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，30 min 后實驗組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品(PILO)30 mg/kg(對照組注射0.9%的生理鹽水)。大鼠在匹羅卡品注射后可在外周出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng)、刻板動作、癲癇發(fā)作直至全身強直-陣攣癲癇大發(fā)作。按照Racine 癲癇行為標準觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達到Racine 分級的IV～V 級的癇性發(fā)作，則可以追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復(fù)注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達60 mg/kg。只有發(fā)作級別達Racine 分級IV～V 級才能進入后續(xù)實驗。治療組分別于造模后30 min、7 d、14 d 腹腔注射單克隆抗體(20 μg/ml)［6］，癲癇組和正常對照組分別給予等量生理鹽水。對造模失敗大鼠通過隨機抽樣原則作及時補充，以保證各實驗組大鼠數(shù)量恒定。模型組、治療組給藥在72 h、21 d 后各隨機取3 只提取海馬組織蛋白測定海馬區(qū)IL-1β 單克隆抗體濃度。各組大鼠在造模后72 h 隨機取10 只用RT-PCR 檢測海馬組織中IL-1β、NF-κB 表達水平以及用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中S100B 含量，在造模后21 d 每組剩余10 只利用免疫熒光法和尼氏染色分別檢測海馬區(qū)膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元凋亡情況。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 組織取材及處理 各組大鼠于各觀察時間點采用10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位，四肢稍固定。對于各組中造模72 h 取材的大鼠，首先局部消毒后打開腹腔，輕柔撥開臟器暴露腹主動脈，用5 ml 注射器取血，將血注入促凝管中，室溫靜止2 h 后離心取上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。治療組中隨機取3 只大鼠，腹主動脈取血后立即脫頸處死大鼠，斷頭取出大腦，并且立即冰上分離獲取海馬，將海馬迅速放入液氮中保存，用于提取蛋白、測定海馬組織中IL-1β 單克隆抗體濃度。各組中隨機取10 只用于提取組織RNA。造模21 d各組大鼠采用上述方式麻醉，依次以0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，分離腦組織置于4% 的多聚甲醛中繼續(xù)固定12 h(4 ℃)，后經(jīng)30%蔗糖脫水沉底，行冰凍連續(xù)冠狀位切片，切片厚15 μm/5 μm，分別用于免疫熒光染色和尼氏染色。

1.3.2 免疫蛋白印記(Western blot) 冰上研磨海馬組織，加入裂解液及蛋白酶抑制劑(RIPA)充分裂解細胞，冰上研磨40 min，離心組織勻漿4 ℃12000 r/min ×30 min，取上清，即為得到組織總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。所得蛋白質(zhì)熱變性備用。各組分別取50 μg 進行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜并封閉，與無標記兔抗小鼠抗體一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T 洗去一抗后加二抗孵育2 h，用ECL顯影，在BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)曝光并定量分析條帶的光密度值。

1.3.3 熒光定量PCR(RT-PCR) 用Trizol 試劑提取大鼠海馬組織總RNA，研缽中加液氮研磨海馬組織，組織研磨至粉末狀時按RNA 提取試劑盒說明書提取海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以1μl cDNA 為模板行PCR 擴增，實時定量PCR 樣品反應(yīng)體系采用SYBR Green I，其最終的反應(yīng)體系20 μl。IL-1β 上游引物:5’-GCCAACAAGTGGTATTCTCCA-3’，下游引物:5’-TGCCGTCTTTCATCACACAG-3’;NF-κB 上游引物:5’-TGGGACGACACCTCTACACA-3’，下游引物:5’-GGCTCAAAGTTCTCCACCAG-3’;β-actin 上游引物:5’-CATCACTATCGGCAATGAGC-3’，下游引物:5’-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3’。PCR 循環(huán)條件為:95 ℃15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃32 s，40 個循環(huán)。每個樣品均設(shè)置相應(yīng)未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對照，繪制IL-1β、NF-κB、β-actin 的熒光曲線和溶解曲線，并得到各自的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct 值)，采用相對定量法2-△△Ct 進行計算實驗組相對與對照組的基因表達量。

1.3.4 ELISA 嚴格參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中S100B 含量，以空白調(diào)零，450 nm 波長檢測各孔光密度D(λ)值。

1.3.5 免疫熒光染色 將冰凍切片常溫下復(fù)溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h，加入抗GFAP(Cy3 標記)及Iba1 一抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗3次，加入FITC 標記驢抗兔二抗，避光室溫條件孵育1 h，PBS 洗凈后加入DAPI 染色3 min，PBS 洗3 次，抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 尼氏染色 將冰凍切片常溫下復(fù)溫30 min，PBS 漂洗3 次，1%甲苯胺藍65 ℃下染色10 min，蒸餾水漂洗，將切片浸入95%鹽酸乙醇中分色，鏡下監(jiān)視分色至滿意效果;蒸餾水沖洗，梯度脫水，二甲苯透明(5 min×2 次)，中性樹脂封片;鏡下觀察并進行海馬區(qū)域神經(jīng)元計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 實驗組大鼠腹腔注射匹羅卡品10～40 min 后開始出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng)，隨后出現(xiàn)癲癇發(fā)作:咀嚼或動須、節(jié)律性點頭、濕狗樣抖動、前肢及后肢痙攣、最后出現(xiàn)全身強直-痙攣發(fā)作并跌倒。按照Racine 分級標準，只有達到IV 級及以上的大鼠進入后續(xù)試驗，癲癇達IV 級以上發(fā)作后1h腹腔注射水合氯醛終止其發(fā)作。造模成功率為85.29%，死亡率10.34%(68 只大鼠，58 只成功建立模型，其中4 只在造模后24 h 內(nèi)死亡，2 只在造模后48 h 內(nèi)死亡)，模型成功后注意保暖，加強呼吸道及體液管理能有效降低模型死亡率。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，無任何抽搐表現(xiàn)，行為正常。

2.2 免疫蛋白印記Western blot 檢測治療組海馬區(qū)IL-1β 單克隆抗體的濃度 模型組大鼠海馬組織中僅檢測到少量IL-1β 抗體，考慮與抗體的交叉反應(yīng)有關(guān)，治療組中給藥后72 h、21 d 后大鼠海馬組織中IL-1β 單克隆抗體的濃度明顯高于模型組(見圖1)。與標準濃度比較發(fā)現(xiàn)不同時間點治療組中IL-1β 單克隆抗體的濃度均＞3.00 μg Ab/g。

2.3 熒光實時定量PCR(RT-PCR)檢測海馬組織IL-1β、NF-κB mRNA 的表達 采用2-△△Ct(RQ)法計算目的基因相對表達率。從擴增曲線和溶解曲線中可以看出，熒光定量PCR 反應(yīng)中目的基因及內(nèi)參得到了擴增，并且擴增產(chǎn)物單一，所得實驗結(jié)果可信。統(tǒng)計結(jié)果顯示模型組IL-1β、NF-κB mRNA 表達量均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。與模型組相比，治療組中IL-1β、NFκB mRNA 表達量均有明顯下降，分別較模型組下降42.11%、35.32%，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

2.4 ELISA 檢測各組大鼠血清中S100B 含量正常對照組大鼠血清中S100B 蛋白水平較低，模型組與正常對照組比較血清中S100B 蛋白水平明顯升高(P ＜0.05)，治療組與模型組比較血清S100B 蛋白水平明顯下降(P ＜0.01)。

2.5 免疫熒光雙重染色法觀察海馬區(qū)膠質(zhì)細胞活化情況 免疫熒光顯微鏡(×400 倍)下觀察，造模后21 d，與對照組比較模型組海馬CA3區(qū)GFAP與Iba1 陽性細胞增多，星形膠質(zhì)細胞(紅色)和小膠質(zhì)細胞(綠色)增生現(xiàn)象顯著(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。治療組GFAP 與Iba1 陽性細胞較模型組明顯減少(P ＜0.01)(見表1、圖2)。

2.6 尼氏染色法觀察海馬區(qū)神經(jīng)元缺失情況正常對照組中神經(jīng)元排列整齊、形態(tài)完整。與對照組相比，模型組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少(P ＜0.05)，錐體細胞排列紊亂，可見部分形態(tài)不完整，胞漿內(nèi)尼氏小體減少。與模型組相比，治療組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元缺失情況明顯減輕(P ＜0.05)，其他病理形態(tài)學改變相對減輕(見表2)。

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)膠質(zhì)細胞數(shù)目()

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)膠質(zhì)細胞數(shù)目()

與正常組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.01

表2 各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目()

表2 各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目()

與正常組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 IL-1β 單克隆抗體在海馬組織中濃度

3 討論

天然免疫反應(yīng)又稱為固有免疫反應(yīng)，是機體防御病原體的第一道防線。吞噬細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，促進多種炎性細胞因子釋放及炎癥反應(yīng)。IL-1 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是組織炎癥反應(yīng)的開始，IL-1β 作為上游炎性因子能介導(dǎo)多種炎性因子表達上調(diào)，因此IL-1β 被稱為“前炎性因子”。國內(nèi)外研究均證實癲癇與IL-1β 有密切的關(guān)系，IL-1β 增加癇性發(fā)作主要通過以下機制:(1)能夠促進谷氨酸釋放、抑制其重吸收［7］，谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)介質(zhì)能降低癇性發(fā)作閾值;(2)介導(dǎo)NMDA 受體NR2B 受體磷酸化，促進神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣超載介導(dǎo)神經(jīng)元損傷［8］;(3)抑制GABA 受體介導(dǎo)的Cl-外流［9］，進而減少GABA 受體介導(dǎo)的抑制性信號傳遞。IL-1β 成熟過程包括兩個步驟:(1)在核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa B(NF-κB)的誘導(dǎo)下IL-1β mRNA 表達上調(diào)［10］，使其釋放增多，除此之外，NF-κB 能促進多種炎性介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄增加，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的瀑布式級聯(lián)擴大;(2)IL-1β mRNA 翻譯后為無生物活性的IL-1β 前體，IL-1β 前體必須經(jīng)過半胱天冬氨酸酶1(caspase-1)活化、切割為具有生物活性的IL-1β［11］，因此caspase-1 是IL-1β 成熟的關(guān)鍵酶。IL-1 受體拮抗劑(IL-1ra)或者抑制caspase-1 活性能有效發(fā)揮抗癇作用［4］。盡管抑制caspase-1 活性能抑制IL-1β 合成，但是并不能完全抑制其合成。這可能與細胞內(nèi)存在潛在“IL-1β 前體儲存池”，抑制caspase-1活性后仍可以在其他酶的催化下以低轉(zhuǎn)化率生成IL-1β［11］。因此抑制caspase-1 活性并不能完全阻斷IL-1β 介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)。

本實驗中我們選用IL-1β 單克隆克隆抗體中和IL-1β 以求達到抑制炎癥反應(yīng)的作用。長久以來一致認為，抗癇藥物能否有效通過血腦屏障是治療癲癇的關(guān)鍵。有研究顯示靜脈、皮下或者腹腔給予抗體類藥物(如抗β-淀粉樣蛋白抗體、抗胰島素樣生長因子-1 抗體、抗干擾素抗體)均能通過血腦屏障［12，13］。Clausen 等研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，并且能維持較長半衰期［6］。體外實驗證實對于中和100 pg/ml 的IL-1β其所需IL-1β 單克隆抗體半數(shù)有效濃度為300 ng/ml［14］，通過蛋白質(zhì)印記法我們檢測到海馬組織中IL-1β 單克隆抗體顯著高于有效濃度(＞3.00 μg Ab/g)。本實驗結(jié)果顯示:正常對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元無缺失，膠質(zhì)細胞無明顯活化，海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA 表達水平低，血清中S100B 蛋白含量少;與模型組比較，治療組大鼠神經(jīng)元缺失、膠質(zhì)細胞活化情況得到改善，海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA 表達水平減弱，血清中神經(jīng)損傷標志物S100B 蛋白含量下降，提示IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，直接中和異常升高的IL-1β，同時阻斷IL-1β 介導(dǎo)的NF-κB 轉(zhuǎn)錄水平升高，減輕IL-1β 炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元缺失及膠質(zhì)細胞活化，而起到神經(jīng)保護作用。但是IL-1β 單克隆抗體能否有效全面抑制癲癇導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)尚不清楚，仍需進一步研究。

圖2 各組大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞活化情況

綜上所述，IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，直接中和異常升高的IL-1β 及阻斷IL-1β 介導(dǎo)的NF-κB 轉(zhuǎn)錄水平升高，減輕IL-1β 炎癥反應(yīng)而起到神經(jīng)保護作用，IL-1β 單克隆抗體對癲癇有效的神經(jīng)保護作用為癲癇治療提供新思路。

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