陳 歷，石秋艷，張春陽，孫 原，李艷玲，楊 斌

近年來，隨著缺血預(yù)適應(yīng)方法的研究深入，發(fā)現(xiàn)由于疾病的不可預(yù)測(cè)性，缺血預(yù)適應(yīng)難以應(yīng)用在臨床［1］。近幾年研究表明，肢體缺血后處理對(duì)腦梗死也有保護(hù)作用。通過無創(chuàng)性的短暫缺血過程，誘導(dǎo)組織產(chǎn)生內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，能夠減輕缺血再灌注損傷，為人們對(duì)缺血防治的認(rèn)識(shí)開辟了新的領(lǐng)域，如何啟動(dòng)、激活這種內(nèi)源性保護(hù)的研究具有積極的現(xiàn)實(shí)和理論意義。本實(shí)驗(yàn)旨在探討肢體缺血后處理對(duì)大鼠急性腦梗死后血腦屏障的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用提供理論研究和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD 雄性大鼠196 只，體重200～250 g，來源于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào):SCXK-(軍)2009-003］，恒溫(26 ℃)安靜環(huán)境中飼養(yǎng)。術(shù)前3 只一籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境至少7 d 后方接受實(shí)驗(yàn)，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前采用抽簽法隨機(jī)分為7 組，每組28 只:(1)假手術(shù)組;(2)缺血再灌注24 h 組;(3)肢體缺血后處理24 h 組;(4)缺血再灌注72 h 組;(5)肢體缺血后處理72 h 組;(6)缺血再灌注5 d 組;(7)肢體缺血后處理5 d 組。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 β-淀粉樣蛋白(Aβ)抗體、EphA2 鼠抗人單克隆抗體、伊文思藍(lán)(EB)(均購于石家莊市勃盛化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 大腦中動(dòng)脈缺血模型［2］參照并改良Zea-Longa 線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO 模型。術(shù)后用墊料蓋于大鼠身上，保持體溫至清醒。術(shù)中維持肛溫在37 ℃左右。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。排除標(biāo)準(zhǔn):抽拉線栓后2 h 昏迷;Zea Longa評(píng)分0 分或者4 分;腦出血;死亡。

1.4 Zea Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0 分:無明顯神經(jīng)缺損癥狀;1 分:提尾垂直時(shí)不能伸展左側(cè)前肢;2分:行走時(shí)向左側(cè)繞圈;3 分:行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒4 分;不能自行行走，意識(shí)喪失。

1.5 肢體缺血后處理方法 暴露雙側(cè)股動(dòng)脈主干，在MCAO 后2 h 及以后每天同一時(shí)間用動(dòng)脈夾給予夾閉2 min，開放2 min，雙側(cè)股動(dòng)脈輪流進(jìn)行，各5 個(gè)循環(huán)，連續(xù)5 d。假手術(shù)組和缺血再灌注組暴露股動(dòng)脈(由非手術(shù)人員隨機(jī)分組)。每天實(shí)驗(yàn)完后用慶大霉素局部消炎。

1.6 右側(cè)腦組織含水量［3］大鼠麻醉后斷頭取腦，去除小腦、腦干及嗅球，電子分析天平稱取腦濕重，置于70 ℃烤箱中烘72 h 稱取腦干重，按公式:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重，計(jì)算出腦組織的含水量。

1.7 伊文思藍(lán)的含量［4］各組在再灌注開始時(shí)即從股靜脈注射2%伊文思藍(lán)(evans blue，EB)溶液(4 ml/kg)，酶標(biāo)儀法檢測(cè)倍比稀釋后的EB 溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得EB 含量(μg/g 腦組織)。

1.8 免疫組化法檢測(cè)EphA2 和Aβ 的表達(dá) 結(jié)果判定及計(jì)數(shù):EphA2 和Aβ 均以胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞，每張切片計(jì)數(shù)5 個(gè)不同400倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)，作為各指標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量比較 與假手術(shù)組比較，再灌注和肢體缺血后處理各時(shí)間右側(cè)腦組織含水量均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。再灌注組24 h右側(cè)腦組織含水量開始升高，72 h 達(dá)高峰，5 d出現(xiàn)下降;肢體缺血后處理也有相同趨勢(shì)的變化，肢體缺血后處理24 h 與再灌注組同一時(shí)間略低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h、5 d 肢體缺血后處理右側(cè)腦組織含水量均低于再灌注組同一時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 右側(cè)腦組織EB 含量比較 假手術(shù)組大鼠右側(cè)腦組織含有少量EB，再灌注和肢體缺血后處理各時(shí)間組均比假手術(shù)組右側(cè)腦組織EB 含量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。肢體缺血后處理24 h與再灌注組同一時(shí)間比較降低不明顯，再灌注72 h、5 d 組右側(cè)腦組織EB 含量明顯高于肢體缺血后處理組同一時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表2)。

2.3 EphA2 表達(dá)的比較 EphA2 陽性表達(dá)為神經(jīng)元胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。再灌注和肢體缺血后處理各時(shí)間組大鼠腦梗死周圍區(qū)域的EphA2的陽性細(xì)胞數(shù)均比假手術(shù)組顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。再灌注組24 h 組EphA2 增多，72 h 達(dá)高峰，5 d 出現(xiàn)下降;肢體缺血后處理變化趨勢(shì)相同，與再灌注組同一時(shí)間比較，肢體缺血后處理72 h、5 d 組EphA2 的陽性細(xì)胞數(shù)均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表3、圖1)。

2.4 Aβ 表達(dá)的比較 Aβ 陽性表達(dá)為神經(jīng)元胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。再灌注和肢體缺血后處理各時(shí)間組大鼠腦梗死周圍區(qū)域的Aβ 的陽性細(xì)胞數(shù)均比假手術(shù)組顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。再灌注組Aβ 隨時(shí)間不斷增多，5 d 開始下降;肢體缺血后處理變化趨勢(shì)相同;肢體缺血后處理24h 組與再灌注組同一時(shí)間比較，Aβ 的陽性細(xì)胞數(shù)差異不明顯(P ＞0.05);再灌注72 h、5 d 組Aβ的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于肢體缺血后處理同時(shí)間組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表4、圖2)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠右側(cè)腦組織含水量比較(%，，n=7)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠右側(cè)腦組織含水量比較(%，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再灌注組相比較#P ＜0.05

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠右側(cè)腦組織EB 含量比較(μg/g，，n=7)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠右側(cè)腦組織EB 含量比較(μg/g，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再灌注組相比較#P ＜0.05

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死周圍區(qū)域EphA2 陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，，n=7)

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死周圍區(qū)域EphA2 陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再灌注組相比較#P ＜0.05

表4 各組大鼠大鼠腦梗死周圍區(qū)域Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，，n=7)

表4 各組大鼠大鼠腦梗死周圍區(qū)域Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再灌注組相比較#P ＜0.05

3 討論

2009 年Ren 等［5］研究表明左側(cè)股動(dòng)脈實(shí)施缺血后處理能夠有效地縮小大鼠腦梗死體積，并且能促進(jìn)遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)。肢體缺血后處理通過腦缺血耐受而調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，提高神經(jīng)元對(duì)缺血的耐受性，延長缺血性腦血管病的治療時(shí)間窗，為缺血性腦血管病的防治提供新的思路［6］。肢體缺血后處理可在腦缺血事件發(fā)生后實(shí)施，操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)人體的損傷微小［7］，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其在急性腦梗死早期實(shí)施溶栓治療或經(jīng)皮血管內(nèi)介入治療時(shí)，適時(shí)予以腦缺血后適應(yīng)干預(yù)，可有效地贏得溶栓時(shí)間窗、減輕缺血再灌注損傷程度，為急性腦梗死的臨床治療提供新的策略。但是遠(yuǎn)端肢體缺血后處理的開始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等因素對(duì)缺血后處理腦保護(hù)的影響，不同的研究間存在爭(zhēng)議。Ren等研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后實(shí)施3 個(gè)循環(huán)的缺血后處理，即刻后處理的保護(hù)效果明顯優(yōu)于3 h 后處理組和6 h 后處理組。CE 等［8］研究顯示，肢體缺血時(shí)間累計(jì)持續(xù)40～60 min 能發(fā)揮最大的保護(hù)效應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證肢體缺血后處理有腦保護(hù)作用，同時(shí)增加操作可行性，本研究采用輪流夾閉雙下肢股動(dòng)脈主干，2 min 缺血/2 min 再灌注，各5 個(gè)周期，連續(xù)5 d。通過測(cè)量不同組別的腦含水量及EB 的通透性發(fā)現(xiàn)，與單純?cè)俟嘧⒈容^，肢體缺血后處理顯著地減少了大鼠腦梗死后血腦屏障通透性，從客觀上證明了肢體缺血后處理對(duì)腦梗死有保護(hù)效應(yīng)。

我們通過免疫組化染色觀察到，假手術(shù)組有少量EphA2 表達(dá)，說明了正常機(jī)體含有少量EphA2 可能與維持正常的中樞神經(jīng)功能的有關(guān)。MCAO 術(shù)后24 h，單純?cè)俟嘧⒑椭w缺血后處理EphA2 均明顯開始升高，72 h 達(dá)高峰，5 d 開始下降;但是與再灌注組同一時(shí)間比較，肢體缺血后處理24 h 組EphA2 的陽性細(xì)胞數(shù)差異不明顯，肢體缺血后處理72 h 及5 d組EphA2 的陽性細(xì)胞數(shù)均明顯較低。說明了腦梗死后EphA2 表達(dá)不斷增多，過多的EphA2 對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用;當(dāng)肢體缺血后處理累計(jì)時(shí)間未達(dá)到閾值時(shí)，產(chǎn)生的保護(hù)效應(yīng)不明顯，當(dāng)達(dá)到閾值后，肢體缺血后處理的保護(hù)效應(yīng)才能體現(xiàn)出來。與以往的研究一致［9］，腦梗死后EphA2 表達(dá)的增高導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，可能是由于被大量激活的EphA2 上調(diào)EphrinA1 配體和EphrinA3 配體，通過一系列信號(hào)傳遞，破壞血腦屏障緊密連接的形成，增加大腦內(nèi)皮細(xì)胞通透性，并且抑制神經(jīng)元再生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。但是，有實(shí)驗(yàn)證明［11］，慢性壓迫性脊髓損傷后由于缺血、缺氧引起VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)上調(diào)，可活化EphA2，從而出現(xiàn)血管新生及微血管改型，增加了局部血液循環(huán)，間接保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞，保存了神經(jīng)功能。EphA2 在急性缺血和慢性缺血中截然相反的作用讓我們看到EphA2 作用的多樣性，目前我們對(duì)它的研究還不夠完善，需要我們更多的研究。

β-淀粉樣蛋白增多會(huì)導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生已得到公認(rèn)［12～14］。但是許多研究表明，腦缺血后Aβ 也增多，主要在腦白質(zhì)以及灰質(zhì)缺血區(qū)周邊，可有數(shù)日到數(shù)周的短暫性升高［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在MCAO 術(shù)后24 h 開始升高，72 h 達(dá)高峰，5 d 開始下降;這與EphA2、右側(cè)腦組織含水量及EB 含量的升高趨勢(shì)大致相同，可以推測(cè)Aβ 的升高與EphA2增加血腦屏障的通透性有關(guān)系，可能由于血腦屏障的通透性的增加導(dǎo)致了外源性Aβ 的增多，導(dǎo)致β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)異常增多，引起了缺血再灌注損傷。而經(jīng)過肢體缺血后處理，72 h 及5 d 組EphA2的陽性細(xì)胞數(shù)均明顯較低。說明肢體缺血后處理能夠減少對(duì)血腦屏障的通透性，從而減少了Aβ 的數(shù)量。由此還可推測(cè)，肢體缺血后處理能夠通過減少Aβ，從而防治淀粉樣血管病和阿爾茨海默病的發(fā)生。但是，由于本實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且樣本量較小，尚需大樣本的實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)。

圖1 MCAO 后72 h 腦梗死周圍區(qū)域EphA2 表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖2 MCAO 后72 h 腦梗死周圍區(qū)域Aβ 表達(dá)情況(免疫組化，×400)

綜上所述，肢體缺血后處理能減輕大鼠急性腦梗死血腦屏障損傷的作用，腦梗死周圍區(qū)EphA2 和Aβ 表達(dá)水平的降低可能為保護(hù)血腦屏障的機(jī)制。

［1］Boiten J，Lodder J.Lacunar infarction:Pathogenesis and validity of the clinical syndrome［J］.Stroke，1991，221:1374 -1378.

［2］李富強(qiáng)，白宏英，婁季宇，等.腦缺血后處理對(duì)缺血再灌注腦組織線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28(9):796 -799.

［3］石秋艷，劉 超，姜進(jìn)克，等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)腦出血大鼠腦水腫和缺氧誘導(dǎo)因子的影響［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24(4):338 -341.

［4］Koyama J，Miyake S，Sasayama T，et al.The novel VEGF receptor antagonist，VGAl155，reduces edema，decreases infarct and improves neurological function after stroke in rats［J］.Kobe J Med Sci，2010，56(1):E1 -E11.

［5］Ren C，Yan Z，Wei D，et al.Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats［J］.Brain Res，2009，1288:88-94.

［6］黨 莎，羅玉敏，吉訓(xùn)明，等.人重復(fù)肢體缺血對(duì)血壓、心率及組織氧飽和度的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28(11):1203-1204.

［7］Madias JE.Remote ischemic postconditioningfor no-reflow inpatients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，2011，5(2):281.

［8］XU C，YI C，Guo H，et al.Limb remote ischemicpostconditioning is e-lective but also time-course-limited in protecting the brain from I/R injury［J］.Turk J Med Sci，2012，42(5):918 -929.

［9］Kullander K，Klein R.Mechanisms and functions of Eph and ephrinsignalling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3:475 -486.

［10］Thundyil J，Manzanero S，Pavlovski D，et al.Evidence That the EphA2 receptor exacerbates ischemic brain injury［J］.Plos One，2013，8(1):e53528.

［11］Zhou N，Zhao WD，Liu DX，et al.Inactivation of EphA2 promotes tight junction formation and impairs angiogenesis in brain endothel ial cells［J］.Microvasc Res，2011，82(2):113 -121.

［12］Goldshmit Y，McLenachan S，Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS［J］.Brain Res Rev，2006，52:327 -345.

［13］張 坤，張宏義，楊 宏，等.神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠慢性脊髓損傷的療效及對(duì)EphA2 的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(28):26 -29.

［12］Masters CL，Simms G，Weinman NA，et al.Amyloid plaque core protein in Alsheimer disease and down syndronle［J］.Proc Nail Aead Sci USA，1985，82:4245 -4249.

［14］欒天竹，戚基萍，王德生，等.局灶性腦缺血海馬神經(jīng)元淀粉樣β蛋白及其蛋白前體的表達(dá)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，85(25):1770 -1772.

［15］Hatip FF，Hatip-Al-Khatib I，Matsunaga Y，et al.Effects of 8-residue beta sheet breaker peptides on aged Abeta40-induced memory impairment and Abeta40 expression in rat brain and serum following intraamygdaloid injection［J］.Curr Alzheimer Res，2010，7:602 -614.